探讨《芽孢杆菌活菌检测方法》

孟俊英

一培养基

营养琼脂培养法

二用具及试剂

超净工作台、灭菌平皿、酒精灯、灭菌试管15×150型及18×180型（放入几粒玻璃珠并加棉塞）、5000/2000/200μL灭菌枪头、无菌水、玻璃涂棒、培养箱。

三步骤

1 制备平板

将营养琼脂灭菌后待冷至55~60℃时倒平板，右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用左手将瓶塞轻轻拔出，瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15亳升，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置在桌面上待凝，培养基凝固后将平板倒置于37℃培养箱中24h进行无菌检测，无杂菌污染者备用。

2 有效菌数及杂菌率的测定

以无菌操作将经过充分混匀的试样5g，80℃灭菌10min，放入含有495mL无菌水带玻璃珠的灭菌三角瓶内，静置20min后置于旋转式摇床上，以200rpm的转速摇min，即成1%的稀释液。

用经过灭菌的1000μL移液器（枪头灭菌）吸取1%的稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL无菌水的试管内（注意枪头尖端不要触及管内稀释液），混匀成1：1000稀释的菌悬液，这样依次稀释，分别得到1：1×104、1：1×105、1：1×106、1：1×107、1：1×108等浓度（每个稀释度必须更换无菌枪头）。

用200μL移液器分别吸取稀释度为1：1×106、1：1×107、1：1×108的稀释液100μL，加至平皿内的无菌培养基表面，用无菌涂布器将菌悬液均匀地涂布于培养基表面。每一稀释度重复3次，同时加无菌水的空白对照，37℃培养20~40h，每个稀释度取5~10个菌落的菌体，涂片染色，显微镜观察识别后计数菌落。

3 菌落计数

以平板上出现30-300个菌落数的稀释度为计数标准。

当只有一个稀释度，其平均菌落数在30~300之间，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数；

若有两个稀释度，其平均菌落数均在30~300之间，应按两面三刀者菌落总数之比值来确定；若其比值小于等于2应计数两者的平均数，若大于是则计数其中稀释度较小的菌落总数；

若三个稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数；

若三个稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数；

若三个稀释度的平均菌落数确均不在30~300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。

4 计算

每克样品的菌数同一稀释度几次重复的平均菌落数×10×稀释倍数

杂菌率=杂菌数/总菌数×100%

首先声明这个方法除斜体字部分外均是引用某公司推荐检验方法。因为存疑所以发贴在此探讨：

（1）斜体字部分是灭菌方法，应对芽孢杆菌的休眠体无损。如果模拟饲料加工条件则干热灭菌与湿热灭菌那个更适合？（注：畜禽饲料制粒时通入的是干饱和蒸汽；水产料则不尽然）

（2）这个培养方法对不同品种的芽孢杆菌的检测结果是否有可比性？

孟俊英

回复 2# 登高远眺

请谈一谈这种方法的有效性。是否仍有改进之处

lswst

菌落计数部分好像有些自相矛盾