大肠杆菌的兽医实验室检测方法步骤

wangqiaomei

各位同仁：我现要做大肠杆菌的分离培养，具体该如何做？以及最新检测方法、各培养基的选择和制作该如何进行，请大家指教！

kdnmk

一、培养基配置

我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线分离。以下为本实验中培养基配置步骤：

1．称量：准确称取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。配置LB固体培养基时还需加1g琼脂。

2．溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到50mL。配置LB固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。

3．调pH：用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。

4．灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。

5．倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是：①将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；③用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。

二、灭菌和消毒

1．无菌技术：①对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；②将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；③为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰旁进行；④避免已灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

2．消毒方法：①日常生活经常用到的是煮沸消毒法；②对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法；③对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒石炭酸或煤酚皂等溶液以增强消毒效果，然后使用紫外线进行物理消毒；④实验操作者的双手使用酒精进行消毒。

3．灭菌方法：①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；②培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅；③表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。

三、细菌的分离

采用划线分离法，其操作步骤是：将培养皿底部用拇指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线 3～5条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线时，接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于恒温箱培养。

四、菌落和菌种种类的辨认

细菌的菌落表面一般是光滑而湿润的，有黏稠性，多数透明或半透明，但也有细菌的菌落表面是干燥、有褶皱的；放线菌由于有纤细的菌丝并可产生孢子，所以菌落表面是紧密的绒状、坚实多皱，长孢子后就成粉末状，由于菌丝和孢子有多种色素，所以在菌落培养基底部和菌落表面都有不同的颜色，菌落不易用接种环挑动；酵母菌落类似于细菌菌落，表面光滑而湿润，有黏稠性但大多呈乳白色，少数呈红色。



共同学习

wangqiaomei

楼上朋友谢谢你的回答，有两个地方不太明白，
在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基这话啥意思不明白呢？能否说清楚点呢？
用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性，偏碱性具体的数值是多少？

haiwuya

其实pH值可以不调的，大肠杆菌对PH的要求不是特别苛刻。
所谓固体的LB培养基，就是再液体LB培养基的基础上添加1.5%-3%的琼脂粉，高压以后，添加了琼脂粉的培养基在60℃左右倒入平皿中，冷却后即为固体的平板。在该平板上划线培养大肠杆菌
顺便问问楼主，你那有普通的光学显微镜吗？大肠杆菌如果做个简单的革兰氏染色，在显微镜下是很容易分辨的。

haiwuya

其实pH值可以不调的，大肠杆菌对PH的要求不是特别苛刻。
所谓固体的LB培养基，就是再液体LB培养基的基础上添加1.5%-3%的琼脂粉，高压以后，添加了琼脂粉的培养基在60℃左右倒入平皿中，冷却后即为固体的平板。在该平板上划线培养大肠杆菌
顺便问问楼主，你那有普通的光学显微镜吗？大肠杆菌如果做个简单的革兰氏染色，在显微镜下是很容易分辨的。

wangqiaomei

有哈~~~~~