饲料中色氨酸测定方法

nzhqlucky · 发表于 2009-7-29 17:43:29

分光光度法

【标准名称】饲料中色氨酸测定方法分光光度法

【标准号】 GB/T 15400-94

【标准文件】

饲料中色氨酸测定方法——分光光度法

（畜禽饲料与添加剂）

1 主题内容与适用范围

　　本标准规定了测定饲料中色氨酸的原理和方法。

　　本标准适用于配合饲料、混合饲料、浓缩饲料和单一饲料。

2 引用标准

GB 6433 饲料粗脂肪测定方法

3 原理

　　饲料中蛋白质经碱水解后，降解成多肽和游离的氨基酸，在酸性介质中，氧化剂存在下，色氨酸吲哚环与对二甲氨基苯甲醛反应生成蓝色化合物，在一定范围内颜色深浅与色氨酸含量成正比。

4 试剂

　　除注明者外均为分析纯。水为蒸馏水。

4.1 硫酸（GB 625）溶液、 c （1/2H 2 SO 4 ）＝21.2mol/L 量取 589mL硫酸徐徐加入约350mL水中，冷却后用稀释至1L。

4.2 1％对二甲氨基苯甲醛溶液：

1.0g对二甲氨基苯甲醛溶于21.2mol/L硫酸（4.1）中并定容100mL。

4.3 0.2％亚硝酸钠（GB 633）溶液（ m / V ）。

4.4 10％氢氧化钾（GB 2306）溶液（ m / V ）。

4.5 L-色氨酸，色谱纯。

4.6 L-色氨酸标准溶液：

　　准确称取 25.0mgL-色氨酸于小烧杯中，加少量0.1mol/L氢氧化钾溶液使之溶解，定量地转移到250mL棕色容量瓶中，用水定容，浓度为100 μ g/mL。

注：本标准溶液 4℃冰箱中保存，一个月内使用，浓度不变。

5 仪器、设备

5.1 分析天平：感量0.1mg。

5.2 分光光度计。

5.3 离心机：转速4000r/min。

5.4 实验室用粉碎机。

5.5 培养箱。

5.6 容量瓶：25mL、50mL、250mL。

5.7 10mL具塞试管。

5.8 刻度吸管：0.5mL、2mL、5mL、25mL。

6 试样的制备

6.1 选取有代表性的试样，按四分法缩分至200g，粉碎，全部通过0.25mm孔径筛（60目）。

6.2 按GB 6433 脱脂并测定脂肪含量。脱脂样品风干后，混匀，装入密封容器内备用。

7 分析步骤

7.1 工作曲线的绘制

7.1.1 吸取色氨酸浓度为100 μ g/mL的标准溶液（4.6）5.00、7.50、10.00、12.50、15.00、17.50mL分别置于25mL棕色容量瓶中用水定容，摇匀。溶液浓度分别为20、30、40、50、60、70 μ g/mL。

7.1.2 吸取各浓度溶液（7.1.1）1mL，分置具塞试管（5.7）中，空白管加1mL水向每支试管内加入氢氧化钾溶液（4.4）1mL，混匀，将试管放入冷水盆中，加5mL对二甲氨基苯甲醛溶液（4.2），从冷水盆中取出试管，摇匀，在室温（20～30℃，下同）放置30min。

7.1.3 向上述每支试管内加0.2mL亚硝酸钠溶液（4.3），摇匀，室温放置25min。

7.1.4 以空白管调零，在590nm波长下，以1cm光径测定各溶液吸光度值。

7.1.5 以色氨酸浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制工作曲线，或列出回归方程式。

7.2 样品测定

7.2.1 称样：按附表A建议的称样量称取脱脂试样两份，精确至0.1mg。

7.2.2 水解：将试样置于50mL容量瓶（5.6）中，在轻轻振摇中缓慢加入25mL氢氧化钾溶液（4.4），使试样湿润且不粘壁，置于40±1℃培养箱（3.5）中水解16～18h。

7.2.3 离心：取出水解液冷却至室温后，用水定容，摇匀，取部分水解液以4000r/min转速离心15min。

7.2.4 显色：取2mL上清液置具塞试管（5.7）中，并将试管放入冷水盆中，加入5mL对二甲氨基苯甲醛溶液（4.2），摇匀。每个试样另取2mL上清液于具塞试管（5.7）中，加5mL硫酸溶液（4.1）作为样品空白，摇匀，室温放置30min。然后向每支试管内加入0.2mL亚硝酸钠溶液（4.3），摇匀，室温放置25min。

7.2.5 比色：以样品空白调零，在590nm波长处1cm光径测定样品溶液的吸光度值。

8 分析结果的表述

8.1 计算公式