抗菌肽的作用机理及其在畜牧生产中的应用

秋深叶一

　抗菌肽（anti－microbial peptides）是生物体内诱导产生的一类具有抗菌作用的生物活性肽，在机体抵抗病原入侵方面起着重要作用。
1 抗菌肽的类型及其结构特点

根据抗菌肽的氨基酸组成和结构特征可分为4类，即天蚕素（cecropins）。防御素（defensins）、蛙皮素（magainins，富含脯氨酸的抗菌肽）和蜂毒素（melittins，富含甘氨酸的抗菌肽）。
　　1.1 天蚕素（cecropins）目前报道的天蚕素约有30种。这类抗菌肽的结构已比较明确，由31～39个氨基酸残基组成，分子量约4kD左右，含较少的半胱氨酸（Cys，不能形成分子内的二硫键，有强碱性的N端和强疏水性的C端，C末端酰胺化。在肽的许多特定位置有较保守的残基，如2位上的色氨酸，5、8和 9位有1个或 2个赖氨酸（Lys），11位是天冬氨酸（ Asp）， 12位是精氨酸（ Arg）。有些位置尽管残基不同，但仍为保守替换。对抗菌肽二级结构的理论预测及CD谱和二维核磁共振数据表明，其分子结构含有两个α-螺旋： 5～21位为第一个螺旋，该螺旋中极性与非极性氨基酸含量相当，因而对水和脂均具亲和性，即为两亲性α-螺旋； 25～37位为第二个 α-螺旋，其疏水氨基酸含量高，故该α-螺旋疏水性强。两个α-螺旋间由22－24位的丙氨酸-甘氨酸-脯氨酸（Ala－Gly－Pro）组成的铰链区（也称结节部）连接。抗菌肽的螺旋-卷曲-螺旋结构特点对保持高抗菌活性具有特殊的重要性，而酰胺化的C端则对其广谱作用极为重要。
　　1.2 防御素（defensins） 防御素是美国Ieherer实验室首次从兔肺巨噬细胞中分离得到的两个阳离子性极强的小分子抗菌肽，命名为defensin。现已在不同种属动物的吞噬细胞中发现了20多种。大多数防御素由38～43个氨基酸残基组成，带有一个净正电荷，含有6个位置保守的半胱氨酸并构成3个分子内二硫键，二硫键与抗菌活性密切相关。defensin由3个结构域组成：1个柔韧的 N瑞环、中部的双亲α-螺旋中心和带有拟β-转角的反向平行的β-片层的C末端。α-螺旋和N端环通过二硫键分别与β-片层的两条链稳定相连，一种  Cys－ Xaa－ Xaa－ Xaa－ Cys或  Cys－ Xaa－Cys结构在不同种类防御素的分子结构中普遍存在，使α-螺旋得以稳定。
　　1.3 蛙皮素（magainins）蛙皮素最初是Zasloff等在非洲爪赠皮肤和胃粘膜腺体上皮细胞中分离到的小分子抗菌肽。这类肽带正电荷，根据其残基数目又可分为两类：一类是小分子肽类，由15～43个氨基酸残基组成，都含有Arg一Pro或Lys－Pro氨基酸对，有些则是典型的Arg－Pro－Arg结构；另一类是分子量较大的肽，由83个氨基酸残基组成。其分子可分为两个明显的结构域，N端富含脯氨酸的P结构域和由其余富含甘氨酸的肽构成的G结构域。
　　1.4 蜂毒素（melittins）这类抗菌肽的共同特点是富含甘氨酸，有些是全序中富含甘氨酸，有些则是某一结构域富含甘氨酸。不含或含很少的半胱氨酸，不能形成分子内二硫键，氨基酸残基上不具修饰基团。分子量为8～27个kD。通常这类抗菌肽均在N端有一个富含脯氨酸的P结构域，C端有一个富含甘氨酸的G结构域。P和G两种结构域的存在可能与其广谱抗菌作用有关。由于其具有较强的溶血作用而限制了其作为抗菌物质的使用。
2  抗菌胱的作用机理
　尽管关于抗菌肽的作用机理已研究得较多，但目前仍未十分明了。现行的抗菌肽作用模型认为，抗菌肽通过在细胞膜上形成离子通道造成内容物大量外泄而致细胞死亡。Christeson等认为，抗菌肽首先通过静电作用被吸引到膜表面，然后疏水尾部插入细胞膜中的疏水区域，通过改变膜构象，多个抗菌肽聚合在膜上形成离子通道，造成细胞内容物泄露致细胞死亡。Fink等认为只有C端的疏水螺旋插入膜中，而N端的双亲螺旋只结合在膜表面。Juvvadi（1997）推测抗菌作用的第1步是抗菌肽的阳离子与膜上磷脂基团的阴离子之间相互作用，再与膜上碳氢化合物互作，然后疏水螺旋插入膜上，聚合形成孔道。Park（1997）发现蛙的1种抗菌肽Buforin具有完全不同的抗菌机理，它不裂解细胞膜，而是穿过膜后与DNA、RNA结合，快速导致细胞死亡。此外，人们还发现抗菌肽可通过抑制细胞呼吸、抑制细胞外膜蛋白的合成或抑制细胞壁的形成等机制来杀死细菌。目前对抗菌肽抗真菌的机理研究较少，Cavallarin（1998）发现位于Cecropins衍生物N末端螺旋区域的11个氨基酸顺序与抗真菌活力有关；Lee等（1989）则观察到真菌受抗菌肽作用后，细胞膜上有空洞形成，推测其与抑杀细菌的机理类同。

研究表明抗菌肽并不作用于高等动物细胞，这可能是由于高等动物细胞膜中的胆固醇阻碍抗菌肽的疏水面插入磷脂双分子层；也可能是由于微生物与高等动物细胞膜的膜外结构的区别：高等动物细胞膜外表面的唾液酸与膜的距离有8nm，它可能与抗菌肽的带正电区结合而阻止其接近细胞膜发挥杀伤作用。
3　动物体内的抗菌研究
　　各种动物在长期自然进化过程中，其体内已建立了一套维持其体内菌群稳态的机制。抗菌肽是这一机制中的主要因子之一，广泛存在于所有脊椎动物和无脊椎动物机体中。例如，猪抗菌肽（PR－39）已被发现（Lee等，1989），它是一个分子量为4719D的肽，从猪肠中分离，属于富含Pro－Arg的肽家族，不裂解野生型大肠杆菌，但对突变型K12有作用，其作用机制是通过阻断蛋白质和DNA的合成，从而导致这些成分的降解。PR－39在一个单层囊泡中可以诱导钙的降低和电流的线性增加，此诱导与肽浓度和膜上甘油磷酸酯（带负电荷）有关。另外在猪小肠中，还发现另一种抗菌肽cecropin PI，它是以裂解细菌来完成杀菌作用的。Andersson（1995）运用基因工程技术从猪骨髓RNA中克隆到一种新型的CDNA，其编码一个78残基的抗菌肽NK－lysin，有3个分子内二硫键，这种肽对NK一敏感型的肿瘤细胞株YAC－1有裂解活性，但不裂解红血球细胞。而在绵羊中至少已发现10种抗菌肽；牛中至少已发现30种抗菌肽；另外，牛奶中也分离到3种抗菌肽，它们具有抑制肠毒性大肠杆菌和单核细胞增多性李氏杆菌的生长的作用。

在水生动物中，Schnapp等（1996）从青圆蟹（Carcinus maenas）的血细胞中分离到3种具有杀菌作用的肽，并对其中的一个6.5 kD的抗菌肽进行部分序列分析。从不同种鲎的血细胞中也分离到多个抗菌肽，发现它们具有与其他昆虫、蛙和哺乳类动物抗菌肽共同的结构特点，即由于多个精氨酸和赖氨酸残基的存在而带阳性电荷，形成两亲性二级结构，能选择性地作用于细菌外层细胞膜的某些组分，如带阴离子的磷脂，增大其渗透性而杀死或抑制细菌的生长，并具有与几丁质结合的活性等。 Park等报道了鲶（Parasiliuus asotus）受伤时上皮粘膜细胞层分泌一种分子量为 2 kD的抗菌肽Parasin I，具有广谱强抗菌活性，没有溶血作用，其抗菌活性是蚌皮素2的12～100倍。对水生甲壳动物及鱼类体内抗菌肽的研究表明，抗菌肽是水生动物防御系统的主要成分之一。
4  抗菌联的基因工程
　　由于抗菌肽具有广谱杀菌作用、相对分子量较小、热稳定、水溶性好等优点，更为重要的是抗菌肽对真核细胞几乎没有作用，仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞，在当前不少病原菌对原有抗生素逐步产生耐药性时，对动物体内自然产生的抗菌肽功能的了解以及设计一种方法来调节动物体内自然抗菌肽的功能以替代抗生素的研究便显得极为重要。其中通过抗菌肽基因的克隆与表达而大量生产抗菌肽是一种较为直接而有效的方法。目前昆虫和植物抗菌肽基因工程，在国内外已有不少成功的报道，但畜禽抗菌肽基因工程国内外尚未见报道。因此，运用基因工程技术，通过对畜禽及水生动物抗菌肽的研究，以提高畜禽及水产养殖品种的抗病能力，将对减少甚至替代抗生素的使用起到积极的促进作用。随着分子生物学技术的发展，抗菌肽在动物生产中的应用前景将十分广阔。
抗菌肽前景广阔的新型抗生素
   随着抗生素的长期广泛应用，病原菌耐药性也日趋严重.;
   广谱抗菌，杀菌力强，尤能杀耐药菌
   自发现青霉素以来，抗生素一直是人类治疗病原微生物感染疾病的有力武器，但随着抗生素的长期广泛应用，病原菌耐药性的形成也日趋严重，迫切要求开发新型抗生素，而且前从微生物中寻找新生物的难度已愈来愈大。来源于动物的抗菌肽(也称为杀菌肽，动物多肽抗生素)的发现，为开发新型抗生素提供了新的广阔的来源。近年来，对抗菌肽的理论和应用研究获得了迅速发展。
   抗菌肽的发现起源于对昆虫免疫机制的研究，当昆虫受到外界刺激时，发生免疫应答反应，在体内诱导产生出具有强烈抗菌活性的物质，抗菌肽是其中重要组成成份。后来，又在两栖动物、哺乳动物中分离得到类似的具有抗菌活性的多肽，使人们对抗菌肽的起源及其在进化中的作用有了新的认识。随着对抗菌肽结构与功能、抗菌肽-生物膜相互作用机理、抗菌肽基因的分子生物学、抗菌肽基因工程等研究的深入进行，抗菌肽在医疗、农业等领域显现出广阔的应用前景。

抗菌肽的概念和分类
   抗菌肽原指昆虫体内经诱导而产生的一类分子量在4KD左右，具有抗菌活性的碱性多肽物质。最初，人们在研究北美天蚕的免疫机制时，发现其滞育蛹经外界刺激诱导后，其血淋巴中产生了具有抑菌作用的多肽物质，这类抗菌多肽被命名为天蚕素(Cecropins)。后来，从其他昆虫以及两栖类动物、哺乳动物中，也分离到结构相似的抗菌多肽。迄今为止，在不同动物组织中已发现了很多具有抗菌作用的蛋白质和多肽，已有70多种抗菌多肽的结构被测定，抗菌肽的概念得到了极大的扩展。
   根据抗菌肽的结构，可将其分为5类：(1)单链无半胱氨酸残基的α-螺旋，或由无规卷曲连接的两段α-螺旋组成的肽；(2)富含某些氨基酸残基但不含半胱氨酸残基的抗菌肽；(3)含1个二硫键的抗菌多肽；(4)有2个或2个以上二硫键、具有β-折叠结构的抗菌肽；(5)由其它已知功能的较大的多肽衍生而来的具有抗菌活性的肽。其中最早分离到的Cecropins和从非洲爪蟾中分离到的Magainins等属于第一类抗菌肽，通常也将其称为Cecropin类抗菌肽，目前对此类抗菌肽的研究也较深入。

抗菌肽的生物学效应
   抗菌肽具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用，尤其是其对某些耐药性病原菌的杀灭作用更引起了人们的重视。
   除此之外，人们还发现，某些抗菌肽对部分病毒、真菌、原虫和癌细胞等有杀灭作用，甚至能提高免疫力、加速伤口愈合过程。
   抗菌肽的广泛的生物学活性显示了其在医学上良好的应用前景。

抗菌肽的作用机制
   自从发现抗菌肽以来，已对抗菌肽的作用机理进行了大量研究。目前已知的是，抗菌肽是通过作用于细菌细胞膜而起作用的，在此基础上，提出了多种抗菌肽与细胞膜作用的模型。但严格地说，抗菌肽以何种机制杀死细菌至今还没有完全弄清楚。
   目前一般认为,Cecropin类抗菌肽作用于细胞膜，在膜上形成跨膜的离子通道，破坏了膜的完整性，造成细胞内容物泄漏，从而杀死细胞。
   对于抗菌肽破坏膜的完整性，使细胞内外屏障丧失，从而杀死细菌这一观点已得到基本统一的认识，但对其具体作用过程、是否存在特异性的膜受体、有无其它因子协同等问题尚不十分清楚，存在不同看法。不同抗菌肽的作用机制可能不一样，尚有待进一步研究。

抗菌肽基因工程
   抗菌肽在动物体内含量极微。从动物体内提取抗菌肽产量低、费时长、工艺复杂、费用昂贵，无法实现大规模生产，这成为制约抗菌肽进入实际应用的最大障碍。因此，开展抗菌肽基因工程研究具有重要意义。
   目前，已进入临床应用的基因工程药物多数是采用原核表达系统生产的，但由于抗菌肽对细菌的杀伤作用，不能用原核表达系统直接表达具有生物活性的抗菌肽，而如果采用融合蛋白的形式表达，将给表达产物的后处理带来很大麻烦。因此，国内外的研究者多采用真核表达系统进行抗菌肽基因工程研究。

   近年来，以酵母为基因工程受体菌的研究引起人们的重视，酵母具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力，并且不会产生内毒素，是基因工程中良好的真核基因受体菌。自1978年Hinnen等首先试验酵母转化成功后，已有人干扰素基因、乙型肝炎表面抗原基因、α-淀粉酶基因等数十种外源基因在酵母中获得表达。国内研究者大量研究表明，利用酵母表达抗菌肽是一条可行的道路，如能在表达产率上得到进一步提高，将为抗菌肽早日进入临床应用奠定良好的基础。

lirong0805

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