饲料中色氨酸含量的测定

hdy198

内容介绍：原理：饲料中蛋白质在酸性条件下水解成游离色氨 酸, 色氨酸吲哚环与对二甲胺基苯甲醛( PDA - B) 反应, 生成蓝色化合物。加入亚硝酸钠进行重 氮化反应, 使蓝色进一步加深, 在一定范围内, 颜 色深浅与色氨酸含量成正比。

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supermen93

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饲料中色氨酸测定方法 分光光度法

【标准名称】 饲料中色氨酸测定方法 分光光度法

【标准号】 GB/T 15400-94

【标准文件】 饲料中色氨酸测定方法 分光光度法 （ 畜禽饲料与添加剂 ） 1 主题内容与适用范围 　　本标准规定了测定饲料中色氨酸的原理和方法。 　　本标准适用于配合饲料、混合饲料、浓缩饲料和单一饲料。 2 引用标准 GB 6433 饲料粗脂肪测定方法 3 原理 　　饲料中蛋白质经碱水解后，降解成多肽和游离的氨基酸，在酸性介质中，氧化剂存在下，色氨酸吲哚环与对二甲氨基苯甲醛反应生成蓝色化合物，在一定范围内颜色深浅与色氨酸含量成正比。 4 试剂 　　除注明者外均为分析纯。水为蒸馏水。 4.1 硫酸（GB 625）溶液、 c （1/2H 2 SO 4 ）＝21.2mol/L 　　量取 589mL硫酸徐徐加入约350mL水中，冷却后用稀释至1L。 4.2 1％对二甲氨基苯甲醛溶液： 1.0g对二甲氨基苯甲醛溶于21.2mol/L硫酸（4.1）中并定容100mL。 4.3 0.2％亚硝酸钠（GB 633）溶液（ m / V ）。 4.4 10％氢氧化钾（GB 2306）溶液（ m / V ）。 4.5 L-色氨酸，色谱纯。 4.6 L-色氨酸标准溶液： 　　准确称取 25.0mgL-色氨酸于小烧杯中，加少量0.1mol/L氢氧化钾溶液使之溶解，定量地转移到250mL棕色容量瓶中，用水定容，浓度为100 μ g/mL。 注：本标准溶液 4℃冰箱中保存，一个月内使用，浓度不变。 5 仪器、设备 5.1 分析天平：感量0.1mg。 5.2 分光光度计。 5.3 离心机：转速4000r/min。 5.4 实验室用粉碎机。 5.5 培养箱。 5.6 容量瓶：25mL、50mL、250mL。 5.7 10mL具塞试管。 5.8 刻度吸管：0.5mL、2mL、5mL、25mL。 6 试样的制备 6.1 选取有代表性的试样，按四分法缩分至200g，粉碎，全部通过0.25mm孔径筛（60目）。 6.2 按GB 6433 脱脂并测定脂肪含量。脱脂样品风干后，混匀，装入密封容器内备用。 7 分析步骤 7.1 工作曲线的绘制 7.1.1 吸取色氨酸浓度为100 μ g/mL的标准溶液（4.6）5.00、7.50、10.00、12.50、15.00、17.50mL分别置于25mL棕色容量瓶中用水定容，摇匀。溶液浓度分别为20、30、40、50、60、70 μ g/mL。 7.1.2 吸取各浓度溶液（7.1.1）1mL，分置具塞试管（5.7）中，空白管加1mL水向每支试管内加入氢氧化钾溶液（4.4）1mL，混匀，将试管放入冷水盆中，加5mL对二甲氨基苯甲醛溶液（4.2），从冷水盆中取出试管，摇匀，在室温（20～30℃，下同）放置30min。 7.1.3 向上述每支试管内加0.2mL亚硝酸钠溶液（4.3），摇匀，室温放置25min。 7.1.4 以空白管调零，在590nm波长下，以1cm光径测定各溶液吸光度值。 7.1.5 以色氨酸浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制工作曲线，或列出回归方程式。 7.2 样品测定 7.2.1 称样：按附表A建议的称样量称取脱脂试样两份，精确至0.1mg。 7.2.2 水解：将试样置于50mL容量瓶（5.6）中，在轻轻振摇中缓慢加入25mL氢氧化钾溶液（4.4），使试样湿润且不粘壁，置于40±1℃培养箱（3.5）中水解16～18h。 7.2.3 离心：取出水解液冷却至室温后，用水定容，摇匀，取部分水解液以4000r/min转速离心15min。 7.2.4 显色：取2mL上清液置具塞试管（5.7）中，并将试管放入冷水盆中，加入5mL对二甲氨基苯甲醛溶液（4.2），摇匀。每个试样另取2mL上清液于具塞试管（5.7）中，加5mL硫酸溶液（4.1）作为样品空白，摇匀，室温放置30min。然后向每支试管内加入0.2mL亚硝酸钠溶液（4.3），摇匀，室温放置25min。 7.2.5 比色：以样品空白调零，在590nm波长处1cm光径测定样品溶液的吸光度值。 8 分析结果的表述 8.1 计算公式 式中： m ── 脱脂试样质量， mg； A ── 从工作曲线上查得色氨酸含量， μ g； F ── 脂肪分率。 8.2 结果的表示 　　两个平行样品的测定结果用算术平均值表示，保留二位小数。 　　试样脂肪含量小于 4％时，式（1）和（2）所得结果在允许偏差之内。 8.3 重复性 　　两个平行样品测定值的相对偏差，当色氨酸含量小于 0.1％时，不大于4％；0.10％～0.50％时，不大于3％;大于0.50％时，不大于2％。 附　录　 A 称　　样　　量 （参考件） 　　根据样品蛋白质、色氨酸含量确定称样量，经试验研究建议不同饲料称样量如下： 蛋白质含量，％ 饲 料 种 类 称样量， mg 10以下 　高粱、玉米 650～700 11～20 　小麦、大麦、糠麸、糠饼、配合料、混合料、各种叶粉等 450～500 21～30 　干酒糟、干粉渣、豆腐渣、杂豆、糟渣类 350～400 31～40 　棉仁饼、菜籽饼、蓖麻饼、向日葵饼、浓缩料 200～250 41～50 　虾粉、豆饼、芝麻饼、酵母、豆粕、花生饼、国产鱼粉 180～200 50以上 　鱼粉、血粉、肉骨粉、蚕蛹、羽毛粉 160～180