常规实验项目操作规程

曹志诚

常规实验项目操作规程

一、细菌的分离培养和鉴定

（一）细菌的分离接种

1、平板划线分离法：

以灭菌接种环取待检材料少许，左手打开平皿盖，使盖与底成30度角，将材料先涂于培养基平板上的一边，作为第一段的划线，然后将接种环置于火焰上灭菌，再以该接种环的第一段划线处相交接依次划线数次为第二段划线，再如上法灭菌，接种划线，依次划至最后一段，灭菌接种环。这样每一段划线内的细菌逐渐减少，即能获得单个菌落，划线时接种环应与培养基面平行，并应尽量将接种环放平，可以减少划破培养基的现象。划线间的距离宽窄要适宜，一般以相距0.5厘米左右为宜。最后一段划线不要与第一段划线相交。接种材料后肉汤培养基中含菌数量不太多时，可用灭菌接种环取待检材料，在平板表面的一角涂布后，由左右两边向下移动连续平行线，直至划满整个平板表面。接种材料后，盖好平皿盖倒置于37℃温箱中培养。

2、斜面分离法；

每份待检材料用三支斜面培养基，以灭菌接种环沾取少许病料，放在第一管斜面培养基底部的凝结水中，共移三接种环，轻轻混合，依次由第一管向第三管移三接种环混合液，将斜面稍平放，使凝结水由底部向斜面流动，左右倾斜，让凝结水布满斜面表面，然后将培养基直立，置于37℃培养，由于病料的递次稀释，第二、三斜面上常可出现单个菌落。

3、平板倾注法：

取数管已溶化的深层琼脂或含有特殊物质的琼脂，用记号笔标记顺序后，置于50℃恒温水箱中，以灭菌接种环或毛细吸管取材料少许加入第一管中，将试管放于两手掌中搓转片刻使材料在培养基中混合均匀，从第一管中取材料1-3接种环，加入第二管中，混匀后，取材料加入第三管中，如此将全部培养基接种完毕。取相同数量的灭菌平皿，标记后，将各管中的材料分别倾于相应的平皿中，并使之均匀分布，待凝固后，将平皿倒置于温箱中培养，此法不仅用于分离培养，而且可用作材料中活菌的记数。

（二）细菌的纯培养

待检材料中的细菌经上述方法分离培养后，取出加以检查。先用肉眼观察长出的菌落是纯一的，还是混杂的。多数情况下，沿涂布划线处长出较多的一种菌落，是材料中的病原菌的可能性较大，少数零散的菌落多为在操作过程中由外界进入的杂菌。为慎重，可挑取一部分菌落，制成革兰氏染色片，置于镜下检查，如片中的细菌的形态和染色性统一，则用灭菌接种环仔细挑取该菌落的剩余部分，接种在适当培养基上，置温箱中培养，待菌落长出后，再经肉眼及染色片的镜检证明统一后，即成为该菌的纯培养。

（三）细菌的生化鉴定

细菌在培养基中生长时，由于它的分解代谢和合成代谢作用，可使培养基中的某些物质转化为其它物质，由于细菌的种类不同，它们的代谢产物也不同。细菌的代谢活动是受细菌本身所具有的酶控制的，细菌的种类不同，它们所具有酶也不同。这些代谢产物和酶，可以利用化学方法检查出来，这种方法可以叫生化实验，生化实验在鉴定细菌种类上有十分重要的作用。

1、大肠杆菌生化特性：葡萄糖○乳糖○甘露醇○阿拉伯糖+吲哚+甲基红+VP-尿素酶-明胶液化-硫化氢-动力+/-柠檬酸盐利用-

2、沙门氏菌生化特性：葡萄糖产气+乳糖-蔗糖-水杨素-侧金盏花醇-靛基质-甲基红+VP-硫化氢+/尿素-明胶-丙二酸钠-氢化钾-动力+赖氨酸脱羧酶+苯丙氨酸脱氨酶-柠檬酸盐+

3、巴氏杆菌生化特性；葡萄糖+果糖+半乳糖+蔗糖+肌醇-菊糖-麦芽糖-水杨素-鼠李糖-吲哚+尿素醇-氧化酶+接触酶+筋胶液化-硝酸盐还原+动力-溶血-麦康上生长-

二、药敏试纸片的制备

（一）配制试剂：

1、PH6.0    磷酸盐缓冲液

磷酸氢二钾  0.2克  磷酸二氢钾   0.8克  蒸馏水 加至100毫升  

15磅高压20分钟备用

2、PH3.0  枸橼酸缓冲液

枸橼酸   0.7克   磷酸氢二钠   0.3克   蒸馏水 加至100毫升

15磅高压20分钟备用

3、PH7.8～8.0  磷酸盐缓冲液

磷酸二氢钾 0.0523克  磷酸氢二钾1.672克  蒸馏水 加至100毫升

15磅高压20分钟备用

4、1N盐酸

盐酸     0.9毫升     蒸馏水  加至10毫升摇匀

5、蒸馏水若干灭菌备用。

（二）药敏片的制备：

1、药物与溶剂使用量

药名	药量(mg)	溶液	溶液量(ml)	代 号	药名	药量(mg)	溶 液	溶液量（ml）	代 号
青霉素	10	PH6.0	4	1	痢菌净	10	水	10	18
新霉素	20	PH6.0	10	2	诺美杀星	20	水	5	15
氨苄青霉素	10	PH6.0	2.5	3	百病消	0.2	水	50	16
庆大霉素	0.5	PH6.0	5	4	先锋6	20	水	15.5	21
土霉素	20	PH3.0	5	5	阿莫西林	30	水	25	22
链霉素	40	PH7.8	13.1	6	力克霉素	40	水	5	23
红霉素	10	水	4	7	环丙杀星	20	水	10	24
氯霉素	40	水	10	8	强力霉素	30	水	15	30
痢特灵	40	水	10	9	喹乙醇	20	水	10	11
氟派酸	20	水	10	10	恩诺杀星	20	水	50	12

2、制备过程：

（1）新华滤纸打出直径6mm的纸片，打上代号，装入青霉素小瓶内，每瓶100片15磅高压灭菌20分钟，取出后烘干备用。

（2）按要求配制药液，然后取药液1ml加入有纸片的小瓶内，使纸片完全浸透药液，4℃冰箱放置1～2小时，取出用无菌镊子将纸片一张张平铺在无菌平皿内，置37℃温箱，将平皿盖开一小缝，以便放出蒸汽，约2～3小时，待干燥后装入无菌青霉素小瓶内，加塞，放入有干燥剂的容器内，冷暗处保存备用。

3、说明：

（1） 金霉素、土霉素、四环素等通常用PH3.0枸橼酸缓冲液稀释。

（2） 青霉素、庆大霉素、卡挪霉素等用PH6.0磷酸缓冲注液稀释。

（3） 对PH要求不严格的药物，如磺胺类药物可用蒸馏水稀释。

（4） 有些不溶于水的药物，可选择可溶解它的溶剂先溶解后再稀释，如四环素用HCL溶解，氯霉素、红霉素等用95%乙醇溶解。

三、染液的配制

（一）改良的革兰氏染色法

1、染液的配制

（1）结晶紫染液   结晶紫1克，蒸馏水100毫升。

（2）革兰氏碘液  碘片10克，碘化钾20克，蒸馏水1000毫升。

（3）脱色剂   95%乙醇2份，丙酮（化学纯）1份。

（5） 复染剂  沙黄1克，蒸馏水100毫升。

2、染色法

（1）抹片，空气干燥，缓慢通过火焰2-3次固定。

（2）用结晶紫染液染色约1分钟。

（3）直接加革兰氏碘液于抹片上（不同法去结晶紫）助染约1分钟。

（4）水洗后，加脱色剂，反复冲洗。

（5）水洗后，用沙黄液复染约30秒钟。

（6）水洗后，用滤纸吸干、镜检。

（二）瑞氏染色法

1、染液配制：瑞氏染色剂粉0.1克，纯粹白甘油1.0毫升，中性甲醇60.0毫升。

置染料于一个干净的乳钵中，加甘油后研磨至完全细末，再加入甲醇使其溶解，溶解后盛于棕色瓶中经一星期，过滤于中性的棕色瓶中，保存于暗处，该染色剂保存时间越久，染色的色泽愈鲜。

2、染色法

（1） 涂片任其自然干燥。

（2）加染色液约1毫升于涂片上，染色1分钟，使标本被染液中的甲醇所固定。

（3）再加上与染液等量的磷酸盐缓冲液（或自来水）用口吹气，使染液与蒸馏水充分混合，并防止染液的沉淀，经5分钟左右，使表面显金属的闪光。

（4）蒸馏水冲洗后，用滤纸吸干、镜检。

四、玻璃器皿的准备

（一）处理

1、新购入玻璃器皿的准备：新购玻璃器皿常附着有游离的碱质，不可直接使用，用前必须先用洗衣粉水或清水洗净，然后在1%～2%盐酸溶液中浸泡24小时，以中和其碱质，最后用清水洗净盐酸，干燥后备用。

2、用后玻璃器皿的处理：凡被病原微生物污染过的玻璃器皿，在洗涤前必须先进行严格消毒。

（1）一般玻璃器皿（如平皿、试管、烧杯、三角瓶等）均可放在高压消毒器内在15磅压力下灭菌20～30分钟。

（2）吸管、玻片、盖玻片等可浸泡于5%石炭酸或其他的消毒剂溶液中48小时。浸泡吸管的玻璃筒底部应铺以纱布棉垫，以防投入吸管时管尖破裂。吸过血清、血液的吸管，若无病菌污染，可立即用清水冲洗。

（3）盛有固体培养基（如琼脂）或油脂（如液体石蜡、凡士林）的玻璃器皿，应于消毒后趁热将其中的培养基或油脂倒净，并单独用温水洗净，以免污染其他玻璃器皿。

（4）凡盛有血液或血清的试管或玻璃瓶等，在高压灭菌之前，必须将其中血清或血液倒入一烧杯中（无病菌污染的血清和血液可直接用清水洗净），然后洗净再进行灭菌。

（5）凡曾吸取琼脂的吸管，不论是否需要消毒，均应于用后立即用热水冲洗干净，然后再进行消毒，否则琼脂凝固，不易冲洗。

（二）洗涤

1、一般玻璃器皿的洗涤

（1）将消毒处理过的玻璃器皿浸泡于清水中，用毛刷或试管刷沾洗衣粉，若器皿上有油污或记号笔标记，用热水刷洗。最后用清水冲洗2～3次。

（2）经清水冲洗后，如仍有污迹，可用清洁液浸泡24小时，取出用清水冲洗干净。如不能立刻刷洗，也应用清水浸泡，以免干燥后不易洗刷。

2、吸管的洗涤

（1）将吸管从消毒剂中取出后，先用细铁丝取出管口的棉塞，若棉塞太紧不易取出时，可将铁丝尖端压扁，插入棉塞与管壁之间，轻轻一转即可将棉塞拉出。

（2）将吸管浸泡于洗衣粉水中，以特制的毛刷或尖端缠有少许棉花的细铁丝洗刷吸管内部，铁丝尖端的棉花应随时更换。

（3）以胶皮管一根，一端接冲洗球，另一端接吸管的尖端，在清水中反复冲洗数次。若仍有污迹，再按（2）处理或置于清洁液缸内浸泡24小时，取出后充分水洗。

（4）洗净的吸管最后再用蒸馏水冲洗一遍，倒立于底部垫有棉花的铁丝筐中晾干。

3、玻片的洗涤  取出经过消毒的玻片放入洗衣粉水中煮沸10分钟，然后用纱布沾洗衣粉擦洗，再经清水冲洗，放入清洁液中过夜，取出后用水洗去清洁液。

4、云雾状玻璃器皿的洗涤：凡玻璃器皿上有云雾状而不能用普通方法洗净时，可用清洁液浸泡24小时，再以清水洗去清洁液。然后用洗衣粉水洗刷干净为止。

（三）干燥

洗净的玻璃器皿倒置于清洁的木架上或铺有清洁纱布的平台上，令其自然干燥。若急需使用，可将玻璃器皿放入50℃左右干燥箱中迅速烘干，但温度不宜太高，以免玻皿破裂。玻皿干燥后，用干净的绸布拭去干后的水迹，玻片干燥后，保存在清洁容器内，或浸于95%酒精中，使用时再用软布擦去。

（四）包装

如玻璃器皿需要灭菌，应于灭菌前将玻璃器皿妥善包装，以免灭菌后被环境中的杂菌污染。

1、平皿的包装：将平皿用纸严密包好，一副或数副包成一包，或放入金属盒（筒）内直接进行灭菌。

2、吸管的包装：吸管包装前，应先用细铁丝塞少许棉花于吸管口端距管口约半寸处，将吸管一一分别用纸包好，然后大纸将数只吸管包成一束，也可将包好的吸管置于金属筒中进行灭菌。

3、试管和其他玻璃器皿的包装：试管和其他玻璃器皿的开口处必须包装严密，加棉塞或直接用纸包扎。棉塞要松紧适度，既要易于拨出，又不能自行脱落为佳。

（五）灭菌

用于盛放无菌材料和细菌分离培养用的清洁玻璃器皿，使用前必须进行灭菌。可用干热灭菌或高压蒸气灭菌。

1、干热灭菌：用干热灭菌箱，通常在160℃温度下处理2小时，温度超过180℃时，棉塞和纸包易烧焦起火。器皿放入烘箱之前必须干燥，以免引起玻璃破碎，器皿在烘箱内不宜过满，应留有一定空隙，灭菌后应待温度降至60℃以下时，才能开门取器皿，否则玻璃可能因突燃遇冷而破碎。

2、高压蒸气灭菌：用高压灭菌器，用15磅压力处理20～30分钟，压力器指针上升至2～3磅时徐徐打开气门，排出灭菌器内所存留的空气，直至排出的蒸气内不夹杂空气为止，然后关紧气门，压力上升至15磅时开始计时。高压蒸气灭菌后，玻璃器皿上常常有水珠，可再用烘箱（60～80℃）烘干。

五、无菌操作技术注意事项

1、为了避免外界环境中细菌的污染。在检测过程中如倾注培养基平板、接种、移种、分离纯菌、活菌记数、制备菌悬液等都要在无菌室内进行，如果没有无菌室，要在酒精灯周围10厘米的无菌区内操作。

2、实验室内必须保持整洁，除必要的设备和仪器外，其它物品都不应放在室内。每天清晨或试验工作结束后，均应打扫卫生，工作台面，边台和桌椅等均用消毒溶液擦拭。

3、实验人员在进入无菌实验室前，必须穿戴整洁的工作衣帽和口罩，换鞋后才允许入内。

4、在检测工作中必须做到严格无菌操作防止污染和感染，使用的器械、容器和培养基等，必须要经过灭菌。

5、在检测工作中，不慎菌液滴在桌面或地面，或溅在其他物体上，必须立刻加以处理，污染的玻璃器皿和器械，可进行高压灭菌或在消毒液中进行消毒。

suweitong

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