猪肠道粘膜防卫系统研究进展

和兴

[作者：林藩平 林祥霖]

养猪生产中,最大的损失是发生在猪出生至断奶期间.造成这种损失的一个基本原因就是仔猪出生时免疫力低下而导致易感肠道疾病.新生仔猪免疫力低下的原因有几个方面：
     1）在子宫内,胎儿发育期不能从母体获得母源抗体,而在出生后通过吸吮初乳才获得一定的免疫保护。
     2）新生仔猪出生后,肠道的发育程度对母源抗体的吸收及其个体的免疫状况都有很大的关系;新生仔猪吸收初乳免疫球蛋白(Ig)最多的时期是吮乳后的4～12小时,而后,由于'肠关闭'(gut　closure)而吸收迅速减少;在哺乳和吸收良好的条件下,新生仔猪的血清抗体可在出生后3小时被检出,血清抗体滴度在出生后4小时可与母猪血清抗体滴度相近。

3）仔猪由初乳获得的抗体组成成分仅限于母猪所接触过的抗原范围,初乳中的Ig主要是IgG,这虽然有助于防御一些全身性病原,但实际上新生仔猪所遭遇的致病原多是存在于肠粘膜表面,而该处却很少有IgG,即使有一点亦多无效。

4）新生仔猪的肠道组织在解剖学和功能上均未发育成熟,而且自身主动免疫机制的建立有所延迟,所以特别容易在母乳抗体水平下降期和其自身免疫机制尚未发育之前遭到病原攻击.因此,深入了解新生仔猪肠道免疫系统发育的过渡模式,进而探讨可采用哪些策略和措施,及早提高幼猪主动免疫功能则成为极为重要的研究课题.下面仅就猪肠道粘膜防卫机制新近研究进展作一个简要的综述.
     1 胃肠的防卫机制
     胃肠道有一个广阔的表面积供动物宿主与各种各样食物、微生物以及外源毒素直接接触,它一方面必须让食物在肠腔与全身血液循环之间进行交换,另一方面又要防止病原侵入,所以,在肠道有一整套严密的防卫机制在起作用.这些防卫机制一般可分为非免疫性和免疫性两类(图1).
     胃是最重要的一个非免疫性防卫机构,它分泌的胃酸和胃蛋白酶可破坏食物性抗原,而且能有效地抑制大多数从口咽部和呼吸道进入的微生物.那些在胃的酸性条件下仍然存活的微生物,在小肠较为碱性的条件下又得以复苏,在这种情况下,宿主还可通过别的非免疫性防卫机制来加以补偿.
     小肠非免疫防卫机制包括胆汁和胰液.肠上皮细胞本身在每个细胞之间靠紧密连接(tightjunction)形成一个单层上皮细胞屏障而防止大的分子通过.肠绒毛上的肠上皮细胞每3～6天更新一次,以进一步减少潜在致病菌的定植机会.肠的运动或蠕动则产生一种机械清除作用,这样亦可防止细菌在小肠上段粘附.专门化肠细胞(如杯状细胞)所分泌的粘液则起着润滑剂的作用,
     保护精细的上皮细胞表面,并发挥其粘性基质的功能,把抗原网罗住,便于胰蛋白分解酶和新的肠上皮的蛋白分解酶在肠腔内将其降解.
     1?1 肠道菌群 大肠的条件,包括pH中性,厌氧及运动减弱,均有利于大量正常菌群生长除了对宿主具有营养价值外,这些内在性肠道菌对健康肠道功能的发育和维持均十分重要.正常菌群最重要的贡献在于它们能够抑制侵入的细菌在肠道定植.这种概念通常称为'定植抗性'(colonization　resistance),它包括形成不适宜的pH环境,争夺营养和肠上皮附着部位以及在局部产生被称为细菌素(bacteriocins)的抗生物质.细菌在大肠以外的胃肠部位的定植程度可因动物种类而异.小肠也有微生态环境:即肠上皮细胞表面,复盖于绒毛上面的粘液凝胶层,隐窝内粘液以及肠腔内容物等.所以,胃肠道微生物生境可分为既有从食道到直肠的纵向分布,也有从肠腔到肠隐窝深部的横向分布.在任何特定生境中存在的细菌菌群都代表着由许多不同细菌组成的最稳定的联合体.这些微生境联合体(microhabitat　communities)也具有宿主动物的特征,而且在某种程度上具有动物营养和环境的特征.以人类为例,有人认为人的大肠中有400种之多的不同细菌菌群,细菌总数达10-13?尽管其对胃肠道的总体发育和健康具有重要性,但在猪方面,尤其对刚出生后和断奶期仔猪情况,则所知甚少.
     有证据表明,正常肠道菌也能在粘膜水平和系统水平上通过促进免疫机制的发育来增强宿主的免疫力.例如,用实验鼠研究显示,正常菌群可以刺激肠道免疫系统的发育.还有,没有正常肠道菌的无菌动物,所有与免疫相关的器官,包括肠管,都没有很好发育,而当引入非致病性肠道菌后,正常的免疫学结构和功能就很快在无菌动物恢复(图2).有一些研究证明这种现象也发生于猪.这些研究都说明,直接饲喂有益菌可增进幼龄猪的免疫力和生长.粘附于上皮细胞表面的菌群都是那些与宿主直接接触的细菌,因此,对这些菌群进行研究将有可能提供重要的资料,以便设计新的策略来促进正在发育的猪肠道的主动免疫.宿主对内在性菌群的紊乱是极度敏感的,而且是通过改变细胞因子(由肠上皮细胞合成)的模式而做出反应的(图3).那么,人们该如何操纵这种关系来活化肠道保护机制?显然这将取决于对内在性菌群与粘膜免疫成分之间的精确平衡中所包含的细胞机制和分子机制的了解程度.
     1?2 免疫防卫 约1/4的肠粘膜是由淋巴样组织组成,而70%以上的免疫细胞,包括在骨髓、胸腺和淋巴结所见的免疫细胞,都可见于肠.肠免疫系统的细胞成分也包括散在的或非组织化的细胞(固有层白细胞和上皮内淋巴细胞)以及高度组织化的淋巴滤泡,如集合淋巴小结(即Peyer?s　patches,丕氏结),该处产生分泌型IgA和B淋巴细胞.
     1?3 固有层 从单层上皮以下至粘膜肌层之间的区域通常称固有层,其中含有大量分散的T淋巴细胞、B淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞、肥大细胞、和少量树突状细胞、嗜酸性白细胞、嗜中性白细胞以及有生物活性的成纤维细胞.这个区域也有良好的血管分布和密布的神经支配.肠管具有丰富的神经丛,它对肠管运动起着重要作用,对上皮细胞功能调节也可能有重要作用.
     肠管免疫的防卫机制是通过局部的化学信号或固有层中的各种细胞所释放的细胞因子来调节的(细胞因子是淋巴细胞分泌的一组蛋白质分子,对各种反应起着信息调节作用).细胞因子有积极的生理效应,也有消极的生理效应,而且还是免疫反应、炎性反应和组织修复的核心介导者.
     例如,免疫反应的扩大就是由长命的记忆细胞、溶细胞细胞(cytolytic　cell)和抗体分泌细胞(具有对特异外抗原的独特受体)经细胞因子调节、分化和增殖而产生的.炎症是一种复杂的系列过程,涉及细胞表面分子对内皮细胞(血管衬里细胞)的表达,从而介导炎性的细胞迁移到激惹部位(感染或损伤)构成炎症反应.在炎症和免疫介导损伤期内,组织修复的机制也开始活跃起来,而这些也是依赖于细胞因子的介导效应.
     巨噬细胞在非炎症肠管的数量约为每克湿重组织一千万个.固有层巨噬细胞在肠管炎症反应和免疫反应中的许多阶段(从开始吞噬和杀死穿入粘膜屏障的细胞,经过招引和激活淋巴细胞到最后通过抑制炎症反应,促进伤口愈合诸过程)都起着重要作用.这些功能都是由局部释放大量外源性信号分子,如细胞因子、生物活性脂类(前列腺素、白细胞介素和血小板凝活因子)、蛋白酶、磷脂酶和各种反应氧而调节的固有层还含有大量肥大细胞,它们与典型的组织肥大细胞在形态学、组织学和功能特性方面均有所不同.固有层肥大细胞与肠神经纤维之间有着紧密的功能和形态的关系.肥大细胞是原始细胞类型,与速发过敏反应或变态反应有关.当局部变态反应时,粘膜肥大细胞数量大增,被致敏的细胞则释放生物活性介质引致组织肿胀,血管和粘膜通透性增高和平滑肌收缩.虽然普遍认为大豆抗原过敏是仔猪断奶生长停滞(weaning　growth　stasis)的重要原因之一,但其确切机理尚需进一步研究。
     嗜酸性白细胞也是肠管组织的一种主要吞噬细胞,它的数量为每克湿重肠组织一百五十万个.嗜酸性白细胞亦可在肠道对致病原侵入作出应答时很快离开血循环而进入固有层.这些吞噬细胞的寿命是以小时计的.这些细胞通过细胞脱颗粒作用(degranulation)所释放出的生物活性物质与巨噬细胞所释放的是相同的,但生成的反应氧代谢物和生物活性脂类的浓度却更高。
     细菌则实际上是借助反应氧代谢物释放进入藏匿着吞噬的细菌的胞内囊泡(intracelluar vesicles)而被杀灭的。
     1?4 肠管T淋巴细胞 肠管T淋巴细胞群,包括上皮内淋巴细胞、居于固有层的细胞亚群和居于集合淋巴小结的淋巴细胞.根据其成熟部位、细胞发育外貌、功能细胞表面(CD)分子表达模式以及所表达的T细胞受体类型(TCR;ab或gd)来加以区别.现在认为,存在于肠道微环境的生长因子补体和细胞因子,可影响在其中发育或驻留的肠T淋巴细胞的表型. 因为肠T淋巴细胞驻留于上皮组织,它们通常被认为是处在与肠致病菌最先接触的防卫前线的重要分子.有一些报导则说明肠T淋巴细胞具有免疫调节作用.
     事实上,肠T淋巴细胞介导细胞毒性作用或涉及对肠腔抗原的口服耐量的程度问题(或者二者兼有之)是一个还在继续争议的问题.根据现有证据,有人预测肠T淋巴细胞的功能多样性是与迄今所证实的表型差异性相一致的,肠T淋巴细胞生物学已成为最近非常活跃的一个研究领域.
     1?5 分泌型IgA 肠管中被记述得最清楚的免疫保障是分泌型IgA.这些免疫球蛋白分子是由来自骨髓而后迁移于集合淋巴小结的B淋巴细胞合成的.肠腔抗原乃通过集合淋巴小结上的专门化上皮细胞即微皱褶细胞(microfoldcell,M细胞)被转移到滤泡间区(interfollicular　area),在该区它们又被驻留抗原递呈细胞(resident　antigen presenting　cells)如单核吞噬细胞系统及树突状细胞等呈递给辅助淋巴细胞(T?H),接着TH又分泌细胞因子刺激B淋巴细胞进行Ig类别特异转换(class?specific　switching),使B淋巴细胞只产生单类抗体.为何集合淋巴小结的微环境有利于Ig类别转向IgA?+表型,其中道理未明.IgA?+B淋巴细胞离开集合淋巴小结后经过全身循环又回归到粘膜表面,在那里它们分化成能分泌大量抗体的浆细胞.当重新引入抗原时,浆细胞就分泌抗原特异的IgA,而后IgA又被一种专门化的上皮受体通过上皮被运送回肠腔,释放于粘膜表面.粘膜IgA抗体是通过三种方式发挥其免疫保护作用的:一是阻止细菌或毒素粘附于肠上皮细胞,二是直接杀死病原菌,三是由抗体依赖细胞介导而发挥其细胞毒性作用.IgA?+B淋巴细胞的再循环特性(回归特征)提供了这样一个机制,即通过在某一特定粘膜部位与抗原接触,可引致在很多粘膜表面产生普遍免疫..这个概念通常称之为'共同的粘膜免疫系统'(common　mucosalimmune　system)(图4).
     2 猪肠道的主动免疫
     关于猪肠道主动免疫的发育研究工作至今还是很有限的.实际上,即使在实验动物和人类方面,把粘膜免疫学作为一个独特的研究领域也只是现在才显示出有较重大的进展,但整个研究发展仍然较慢.大部分猪方面的资料均偏重于分泌型IgA系统.最近少数几个研究小组已集中研究猪肠道T淋巴细胞亚群的定位.
     如上所述,了解最清楚的肠道免疫屏障是分泌型IgA,在猪的空肠和回肠上段大约有30个左右的分散集合淋巴小结,在回肠终端有一个长形连续的淋巴集结,大肠约有10个左右不规则螺旋状的集合淋巴小结.虽然集合淋巴小结的大小在发育过程会增大,但其数量和部位却保持恒定.猪集合淋巴小结中淋巴细胞亚群的组成也会有发育性的变化,例如IgM+B淋巴细胞的数量一直到三周龄才超过IgA+细胞,而三周龄后IgA+开始占优势.到了四周龄,IgA+B淋巴细胞达到成年数量,而IgM+B淋巴细胞数直到3～4月龄还在继续增加.集合淋巴小结中T淋巴细胞(CD4+和CD8+)数量的增加现象也曾见于猪.根据所研究的肠道区段,猪肠道的主动免疫直到4～7周龄才开始发育.具有重要意义的是新生猪在这个时期正好与曝露于肠道感染原的高峰期相近。
     猪出生时T和B淋巴细胞均存在于固有层,但出生后头四周细胞数加倍.随着数量增加,未成熟T淋巴细胞分化为CD4?+和CD8?+T淋巴细胞亚群(cluster　of　differentiation,CD,分化抗原簇)而显示不同的发育模式.例如,CD4?+T细胞在出生后头一周数量明显增加,而CD8+T细胞数量在出生时很低,到了5～7周龄也只是略有增加.成年猪固有层中的CD8?+淋巴细胞如同它们在血液中一样都是占优势的.因此,T淋巴细胞亚群分异为CD4?+细胞在绒毛固有层中心占优势,而CD8+细胞则靠近基底膜.至少有一个报导称,猪肠道T细胞对外来病原的应答功能
     直到9～11周才发育完成,而且这种发育滞后的意义也不明,值得进一步研究.
     最近有一个研究对新生仔猪肠道抗原递呈细胞功能发育方面的问题做过评价,该研究指出,作为抗原递呈细胞优势型的巨噬细胞在仔猪出生时都是以低数量平均分布于绒毛固有层和隐窝区.巨噬细胞的数量在出生后不久就增加,并开始聚集于隐窝区固有层,一直到五周龄时才达到成年细胞数;树突状细胞是另一种重要的抗原呈递细胞,其数量也随着出生后年龄而增加,但是这些细胞聚集于绒毛固有层而不是像巨噬细胞那样聚集于隐窝区固有层.这种在固有层抗原呈递细胞明显分隔化的功能意义尚未明确.已知抗原呈递细胞在炎症和免疫机制中都具有核心作用,故对猪的这类细胞还需作进一步研究.
     3 小结与前景
    关于幼龄猪在发育中延迟建立主动免疫机制的问题和关于猪免疫系统的独特的细胞学和分子学方面还有大量的事实需要了解.营养对粘膜防卫机制发展的影响还很少被人注意.我们对猪肠道,特别是当出生后不久和断奶时的关键期肠道的了解实在太少.抗生素被广泛用于养猪业以促进生长和提高饲料效率,然而这些重要作用中所包含的机制至今尚难明确.当越来越多的人开始关注动物产品抗生素残留问题和在更广泛的环境中出现抗生素耐药性的真正威胁时,这种情况的重要性就变得更加明显了.或许,直接饲喂的微生物代表着一种可行的替代办法以取代在动物饲料中广泛使用抗生素.但是,对直接饲喂的微生物可增进动物健康和生长性能的机制所知甚少。
     鉴于因幼龄猪免疫力低下所造成的死亡的普遍性,加强旨在了解这些重要问题的研究工作肯定是会有效益的。