川楝素妊娠毒性作用与孕鼠INF-γ、TNF-α含量的相关性研究

貔貅

长期以来，农药残留对于公众健康的危害是以引起癌变作为指标。近年来由于农药残留对生殖和发育危害的后果突出，被认为可能是造成不孕、流产、功能异常和畸形等因素之一。有研究表明动物生殖和胚胎发育过程对农药毒物似乎更加敏感。因此，农药对生殖和发育的危害及其后果的分析成为生殖和发育毒物学中重要的研究内容，并逐渐进入各国的食品常规分析和检测项目中。川楝素(Toosendain)是从传统驱蛔中药楝属植物川楝树或苦楝树的根皮苦楝（Melia azedarach L）皮、川楝（Melia Toosendain Sieb.et Zucc）子中提取的一种四环三萜类化合物[1,2]。最早于1953年由四川省中药研究所提取，主要用来驱虫，近年来也用于农业杀虫[3]。关于楝树的杀虫作用，历史上有不少记载，《神农本草经》中记有楝树“杀三虫”。苏东坡所著《格物粗谈》中记载，“收苦楝花或叶藏席下可避蚤虱”，“端午取楝子碎投厕中不生虫”。已有研究表明，一定剂量的川楝素能使小鼠完全流产[4]。现在川楝素多用于蔬菜、瓜果的杀虫，其在蔬菜、瓜果上残留的是否对人类尤其是孕妇有潜在的影响呢？研究川楝素对动物的生殖毒性作用和机理，以及剂量和效应关系，对于丰富中药药理学内容，保证川楝素作为农业杀虫剂的安全使用，有着重要的意义。　　1　材料和方法　　1.1试验动物
　　10周龄未经产纯种BALB/c系小鼠（清洁级），购自河北医科大学。常规饲养，自由采食。日光照12h。经适应环境1周后，眼观检查结合阴道涂片法进行发情鉴定。阴道涂片经姬姆萨染色，镜下观察全部为无核角化上皮细胞定位发情。发情母鼠与公鼠1：1合笼过夜，于次日清晨，见有阴栓者定位孕0d。
　　1.2试验药品及配制
　　川楝素提取物（含量90%），购自深圳市倬源实业发展有限公司，用10%丙二醇生理盐水（经细菌滤器过滤消毒）稀释成20μg/mL。
小鼠TNF-α、INF-γ ELISA试剂盒，R＆D Systems明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国，购自晶美生物公司。
　　1.3试验动物分组与处理
　　试验分5组。经预试验发现，腹腔注射10%丙二醇生理盐水对孕鼠的妊娠没有影响。A组在孕5、6、7d时腹腔注射10%丙二醇生理盐水。川楝素对小鼠的腹腔注射LD50是13.8mg/kg[4]，B、C、D、E组孕鼠在孕5、6、7d时分别腹腔注射川楝素溶液1/60 LD50、1/30 LD50、1/20 LD50、1/15 LD50。注射前用天平称取每只小鼠的体重，计算注射剂量。于孕8d眼球采血处死小鼠，取上清，用于测定血液中细胞因子的含量；取右侧子宫匀浆，测定细胞因子的含量。
　　1.4流产判定及胚胎吸收率、流产率的计算
胚胎体积变小、颜色紫黑、出血坏死、呈血团状、镜检无胎膜结构为胚胎吸收或死亡。胚胎个体大，粉红色，镜检胎膜及胎儿轮廓清晰，无出血、淤血者为正常胚胎。按下列公式[5]计算试验各组的流产率和胚胎吸收率。
　　流产率=发生流产的母鼠数/试验组母鼠总数×100%
　　胚胎死亡（吸收）率=死亡胚胎数/（死亡胚胎数+正常胚胎数）×100%
　　1.5TNF-α、INF-γ的测定
　　眼球采血，12000r/m，4℃离心10min,取上清液分装备用。取右侧子宫，剪除子宫系膜及脂肪，纵向切开子宫，剥去胎儿，剪碎子宫角，加入6倍于子宫质量的含有PMSF（蛋白酶抑制剂0.75μg/mL）的PBS（pH7.4）。在冰水环境中立即进行匀浆，12000r/m, 4℃，离心15min，取上清液分装，-80℃冻存待检。TNF-α、INF-γ的测定均按试剂盒说明操作。加终止液后即刻在318MC型酶标分析仪(上海三科仪器有限公司)450nm处读取OD值，利用已知浓度的标准样品OD值绘制标准曲线，据此标准曲线计算各细胞因子含量。
　　1.6统计方法
　　使用Excel 2000和SPASS12软件包,以单变量方差分析和卡方检验进行统计，数据以均值±标准差()表示，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。
　　2　结果　　2.1川楝素溶液致早期孕鼠流产的效果
　　对照组A组本身有一定的自然流产率14.29%，胚胎吸收率13.04%；B组流产率50.00%，与A组相比较，流产率差异不显著（P>0.05），胚胎吸收率为42.59%，与A组比较差异极显著（P<0.01）；C组流产率为 62.5%，与A组比较差异显著（P<0.05），胚胎吸收率为46.55%，与A组比较差异极显著（P<0.01）；D组流产率为 75.00%，与A组比较差异显著（P<0.05），胚胎吸收率为70.37%，与A组比较差异极显著（P<0.01）；E组流产率为 89.89%，与A组比较差异极显著（P<0.01），胚胎吸收率为73.77%，与A组比较差异极显著（P<0.01）。胚胎吸收率B组与D、E组比较差异极显著P<0.01）；C组与D组比较差异显著（P<0.05），与E组比较差异极显著（P<0.01）；D、E组间差异不显著（P>0.05）。B、C、D、E各组之间流产率差异不显著（P>0.05）。详见表1。

　　表1　不同剂量川楝素的流产效果

组别 roup	流产率(%) Abortion rate(%)		胚胎吸收比率(%) Rate of embryo resorption(%)
A对照组		14.29%(1/7) cdE		13.04%(6/46)BCDE
B组 1/60LD50川楝素注射液		50.00%(4/8)		42.59%(23/54)ADE
C组1/30LD50川楝素注射液		62.50%(5/8)a		46.55%(17/58)AdE
D组1/20LD50川楝素注射液		75.00%(6/8)a		70.37%(38/54)ABc
E组1/15LD50川楝素注射液		88.89%(8/9)A		73.33%(44/60)ABC

　　注：小写字母不同表示差异显著（P<0.05）,大写字母不同表示差异极显著（P<0.01），以下同。
　　2.2血清和子宫组织中TNF-α测定结果
　　川楝素可以提高血清和子宫组织中TNF-α的含量。B组注射1/60 LD50的川楝素溶液，TNF-α在子宫组中含量为1893.378±61.236pg/g蛋白，显著高于对照组A组（P<0.05），在血清中含量为31.938±9.827 pg/mL，显著高于对照组A组（P<0.05）；C组注射1/30 LD50的川楝素溶液， INF-γ在子宫组织中含量为2263.128±281.934pg/g蛋白，极显著高于对照组A组（P<0.01），血清中含量为55.979±29.753 pg/mL，极显著高于对照组A组（P<0.01）；D组注射1/20 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宫中的含量为2008.374±175.374pg/g蛋白，极显著高于对照组A组（P<0.01），血清中含量为43.438±14.965 pg/mL，极显著高于对照组A组（P<0.01）；E组注射1/15 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宫中的含量为1997.436±271.146pg/g蛋白，极显著高于对照组A组（P<0.01），血清中含量为32.688±11.264 pg/mL，显著高于对照组A组（P<0.05）。子宫组织中INF-γ含量C组与B组比较差异显著（P<0.05），血清中的INF-γ含量C组与B组、E组比较差异显著（P<0.05）。详见表2。

　　表2　各处理组血清和子宫组织中TNF-α的含量

组别 Group	血清(pg/mL) Blood sperum (pg/mL)	子宫组织（pg/g） Uterus tissue (pg/g)
A对照组	3.729±0.144bCDe	1439.628±163.074bCDE
B组1/60LD50川楝素注射液	31.938±9.827ad	1893.378±61.236ac
C组1/30LD50川楝素注射液	55.979±29.753Abe	2263.128±281.934Ab
D组1/20LD50川楝素注射液	43.438±14.965A	2008.374±175.374A
E组1/15LD50川楝素注射液	32.688±11.264ad	1997.436±271.146 A

　　2.3血清和子宫组织中INF-γ测定结果
　　川楝素可以提高血清和子宫组织中INF-γ的含量。B组注射1/60 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宫组中含量为3724.998±421.212pg/g蛋白，显著高于对照组A组（P<0.05），在血清中含量为42.656±15.118pg/ pg/mL，极显著高于对照组A组（P<0.01）；C组注射1/30 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宫组织中含量为4182.402±608.154pg/g蛋白，极显著高于对照组A组（P<0.01），血清中含量为56.250±22.991 pg/mL，极显著高于对照组A组（P<0.01）；D组注射1/20 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宫中的含量为3805.002±243.864pg/g蛋白，显著高于对照组A组（P<0.05），血清中含量为37.813±10.7892 pg/mL，显著高于对照组A组（P<0.05）；E组注射1/15 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宫中的含量为3633.600±374.568pg/g蛋白，显著高于对照组A组（P<0.05），血清中含量为34.219±8.646 pg/mL，极显著高于对照组A组（P<0.01）。INF-γ在子宫组织中的含量各实验组之间差异不显著（P>0.05）；血清中的INF-γ含量C组与B组比较差异不显著（P>0.05），与D组相比较差异显著（P<0.05），与E组比较差异极显著（P<0.01）。详见表3。

表3　各处理组血清和子宫组织中INF-γ的含量

组别 Group	血清(pg/mL) Blood sperum (pg/mL)	子宫组织（pg/g） Uterus tissue (pg/g)
A对照组	6.000±0.354BCde	2743.998±169.704bCde
B组1/60LD50川楝素注射液	42.656±15.118A	3724.998±421.212a
C组1/30LD50川楝素注射液	56.250±22.991AdE	4182.402±608.154A
D组1/20LD50川楝素注射液	37.813±10.7892ac	3805.002±243.864a
E组1/15LD50川楝素注射液	34.219±8.646aC	3633.600±374.568a

　　3.讨论
　　孕8d剖检，1/30LD50的剂量使孕鼠达到62.5%的流产率，与对照组比较差异显著。1/20LD50、1/15LD50川楝素溶液由于导致75%、88.89%流产，因此剂量偏大，不适合做流产模型；而1/60LD50的流产率又偏小，1/30LD50的剂量使流产率达到62.5%，又有一定的成活的胚胎，与对照组比较显著差异（详见表1）。因此，1/30LD50的川楝素溶液流产效果比较理想，所以选择1/30LD50为川楝素致流产的最佳剂量。
　　川楝素本身有一定的毒性。腹腔注射大剂量川楝素可引起急性中毒，主要致死原因是由于血管壁通透性增加，引起内脏出血，血压下降而形成急性循环衰竭。张先福研究表明[4]，给妊娠早期母鼠腹腔注射最大剂量不到1/10的LD50（13.8mg/kg）川楝素，就会使胚胎异常，产生毒性作用。本研究给孕5d的小鼠连续3d腹腔注射川楝素溶液，通过解剖发现，具有子宫出血、子宫水肿，胚胎死亡的孕鼠数量显著高于对照组（P<0.05）说明川楝素的致流产作用明显，与前人的工作是相吻合的。由本研究结果可以看出，给孕5d的小鼠注射川楝素溶液后，TNF-α、IFN-γ的含量显著增加，说明川楝素可以促进Th1细胞因子TNF-α、IFN-γ的分泌。
　　本试验结果表明，孕5d小鼠注射不同剂量的川楝素溶液后，在导致流产的同时TNF-α、IFN-γ的含量升高。TNF-α和IFN-γ都属于Th1型细胞因子。近年来，普遍认为早期胚胎丢失与子宫免疫环境有密切关系，提出白介素-2（Interferon-2,IL-2）、肿瘤坏死因子（Tumour necrosis factor,TNF）,以及γ-干扰素（Interferon-γ）等可导致胚胎死亡[6]。
　　TNF-α主要由Th1细胞分泌，活化NK细胞和肥大细胞也分泌一部分[7]。TNF-α导致流产已被动物试验所证实。Gendron等报道，LPS诱导小鼠流产与子宫内的TNF-α增多有直接关系[8]。将人工重组TNF-α直接注入孕鼠体内，亦可引起流产[9]。同时，TNF-α能抑制滋养层细胞DNA合成及增生。TNF-α为重要的炎症介质和免疫调节因子，是造成胎盘坏死的终末介导物之一。 TNF-α对生殖过程有重要影响[10,11 ],在小鼠的怀孕期被严格地控制着[12] 。TNF-α异常对妊娠时胚胎存活是有害的[13]，母体TNF-α可能影响囊胚生长和着床[14,15]
　　TNF-α在黄体形成期起着重要的调节作用，抑制胚泡着床[16]。TNF-α能诱导滋养层细胞凋亡，促进胎盘血管血栓形成，诱发宫缩使着床的胚胎坏死、排出。TNF-α与IL-2共同作用还可使NK细胞活化，损害胎盘组织。TNF-α参与抗体依赖细胞毒作用，并使前列腺素增多导致流产[17]。但是大量资料表明，正常妊娠期间适量TNF-α能促进分解代谢，从而满足胎儿的营养需要，对其他细胞因子及黏附分子的表达具有一定的调节作用，在维持正常妊娠的顺利进行中必不可少，参与了妊娠期间免疫平衡的建立和稳定[18]。
　　IFN-γ主要来自活化的T细胞、NK细胞、胎盘滋养层细胞及绒毛间质霍夫包尔氏细胞， IFN-γ通过诱导单核巨噬细胞的主要组织相容性复合体（MHC）-Ⅱ类抗原表达，参与抗原递呈和特异性免疫识别过程[19]。原因不明习惯性流产患者血清中平均IFN-γ含量明显高于正常对照组（P﹤0.05）[20]。试验证明，一定浓度范围的IFN-γ（10~1000ng/mL）可明显抑制绒毛膜滋养层细胞活性及其hCG分泌，其抑制作用呈剂量依赖性[21]。IFN-γ/IL-4可能通过影响胎盘滋养层细胞活性及hCG分泌而在早期妊娠中起重要的免疫调节作用[22]。由此可以说明，IFN-γ浓度的升高伴随着hCG分泌量得降低，从而不利于妊娠的进行。曹永清等人发现人重组IFN-γ对人子宫蜕膜组织蛋白的合成呈抑制作用，给孕兔注射导致胚泡着床率降低80%左右。IFN-γ能够活化Mφ,使其具有抗原递呈能力，此种作用可以被IL-10抑制[23]。体外试验证明，IFN-γ抑制滋养层的生长，IFN-γ与INF-α协同作用可抑制胚胎的生长发育，上调胚胎MHC-I类抗原的表达，IL-2诱导蜕膜NK样细胞增殖并使其转化为具有杀伤滋养层细胞的表型。Th1型细胞因子可能通过激活NK细胞与LAK细胞而作用于胎儿胎盘组织，导致妊娠失败[24]。白血病抑制因子（LIF）和IFN-γ都是由母胎界面的细胞和组织所分泌，LIF促进胚胎的着床有利于妊娠的进行，IFN-γ却不利于妊娠[25]。
　　本试验结果表明，苦楝皮及其单体成分川楝素能导致孕鼠流产，使子宫内Th1型细胞因子IFN-γ、TNF-α含量升高，从而打破了母胎界面Th1/Th2的平衡，导致流产的发生。