特异性卵黄抗体

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特异性卵黄抗体 来源:中国兽药114网 编者:乐天 时间:2007-10-30 9:10:57 仔猪大肠杆菌性腹泻是由猪致病性大肠杆菌引起的一种常见传染病，具有发病急、传播快。死亡率高等特点，严重危害养猪业。产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia colt，ETEC）是引起新生和断奶仔猪腹泻的主要致病菌之一（Yokoyam等，1992）。长期以来，该病的防治主要依赖于抗菌药物、大肠杆菌多价苗和基因工程疫苗。然而，抗生素在动物体内会导致药物残留和产生抗药性；用疫苗免疫母猪，虽可提高母乳中抗体含量，但母源抗体持续时间短，木足以保护仔猪整个生长阶段不致病；口服高免动物血清虽能有效防治该病，但成本较高很难在生产中推广应用。因此，寻找一种使用方便、成本低、绿色环保且能有效防治仔猪腹泻的生物制剂已成为养猪业发展中急需解决的问题。卵黄抗体亦称卵黄免疫球蛋白（Egg Yolk Immunoglobulin，IgY），是一种高效防治仔猪大肠杆菌性腹泻的生物制剂，利用蛋鸡生产特异性卵黄抗体具有可规模化生产、成本低、特异性抗体含量高及安全性好等优点（李国平等，200人目前，采用特异性卵黄抗体防治仔猪腹泻已取得可喜进展，本文就此作一简述。IETEC引起仔猪腹泻的致病机理及卵黄抗体抗ETEC感染的作用机理 ETEC引起仔猪腹泻的主要致病原是具有宿主特异性的菌毛和肠毒素。首先，ETEC通过特异性菌毛吸附到小肠粘膜上皮细胞表面的受体上，这种牢固的结合使菌体能够抵抗肠道蠕动产生的冲刷作用从而定植下来。然后ETEC大量繁殖，并产生肠毒素。研究证实，每个上皮细胞平均可粘附 K88＋（或 K99＋ ）ETEC 22．5～35．l个（李学伍 等，2001）。ETEC的特异性菌毛具有高度专一的粘附性，亦称粘附素、粘着素或定植因子。引起仔猪腹泻的ETEC特异性菌毛主要有K88、K99、987P、F41和 F18。ETEC的肠毒素分为耐热肠毒素（heat stable enterotoxin，ST）和不耐热肠毒素（heat labile enterotoxin，LT）两种。阿是通过激活肠粘膜细胞表面的鸟音环化酶（GC），使胞内CGMP含量增多从而导致腹泻。LT由1个A亚单位和5个B亚单位组成，A亚单位是毒素的活性部位，B亚单位与肠粘膜上皮细胞表面的GMI神经节着脂结合后起到使A亚单位穿越细胞膜与腺音环化酶（AC）作用，促使胞质内CAMP水平升高，进而导致肠粘膜细胞内水、钠、氯、碳酸氢钾等过度分泌至肠腔引起腹泻（华荣虹等，2002a）. 卵黄抗体经仔猪口服后有抗ETEC感染的作用，它能与特异性菌毛抗原结合，减少或阻断菌毛粘附到仔猪肠道粘膜上皮细胞表面，使ETEC不能在小肠定居繁殖，从而不能分泌肠毒素防止了腹泻的发生(Marquaalt等，1999)。 2 特异性卵黄抗体在防治仔猪大肠杆菌性腹泻中的应用 2．l 以 ETEC菌体为抗原徐福洲等（2002）利用ETEC的K88、K99、987P标准菌株制备单价菌体油乳剂灭活苗，用以免疫产蛋母鸡，琼脂扩散效价。1：64时收集卵黄，用提纯后的卵黄抗体对攻毒的新生仔猪口服治疗，结果显示治疗组仔猪腹泻症状明显减轻，与对照组相比有显著差异：治疗组未出现死亡病例，而对照组仔猪死亡率为33％～67％。可见，特异性 IgY对 ETEC引起的仔猪腹泻具有明显的防治效果。李国平等（2002）用ETEC的K88、K99、987P和F41标准菌株制成多价菌体油乳剂灭活苗，对蛋鸡免疫后收集高免卵黄，提纯后精制成抗大肠杆菌特异性高免卵黄抗体并应用于临床。结果表明，每头新生仔猪口服2～4mL该卵黄抗体可有效预防仔猪大肠杆菌性腹泻，且安全性很好。高云英等（2003）用ETEC的K88、K99、987P标准菌株和地方分离菌株制成多价菌体油乳剂灭活苗，免疫商品蛋鸡，收集高免蛋制备多价卵黄抗体。经预防、攻毒试验及临床治疗效果观察，对新生仔猪免疫保护率可达90％以上，3日龄仔猪攻毒保护率达98％以上，3～11日龄仔猪临床治愈率达95％以上。 2． 2 以ETEC的特异性菌毛为抗原 ETEC的特异性菌毛位于细菌表面，为非鞭毛的细丝状附加物，长约0．2～1．3 μp（Mooi等，1985）。菌毛是ETEC的一个重要毒力因子，其成分为蛋白质，化学本质为菌毛蛋白亚单位，具有良好的抗原性（崔德风等，2001）。各种菌毛对肠上皮细胞表面的粘附作用具有宿主特异性，并只能粘附于具有相应受体的特定动物的肠细胞上（见表1）。因此，用不同菌毛抗原免疫蛋鸡可获得相应的特异性卵黄抗体。华荣虹等（2002）分别用 K88、K99、987P和F41菌毛蛋白苗对产蛋鸡进行免疫，结果表明88免疫性最强且各菌毛单独免疫后的抗体效价均高于混合菌毛苗免疫后相应的抗体效价。他们还比较了由木同免疫佐剂（弗氏佐剂、白油性剂、氢氧化铝胶、蜂胶）制备的K88佐剂苗的免疫效果，其中弗氏佐剂和白油性剂诱导产生的抗体效价高。持续时间长，是较合适的佐剂。 表1 ETEC的主要宿主特异性菌毛及其粘附位置 宿主特性菌 粘附位置 K88 只能粘附于仔猪十二指肠段 K99、987P 可粘附于初生猪、牛、羊的空肠 F41 只能粘附于仔猪回肠 注；资料来源于崔德凤等（2001）。 Yokoyama等（1992）将提纯的ETEC宿主特异性菌毛 K88、K99、987P制成单价菌毛蛋白苗，免疫蛋鸡获得卵黄抗体粉末，ELISA检测结果表明，抗K88、K99、987P的卵黄抗体能够特异性地与相应的菌毛抗原作用，用卵黄抗体对不同ETEC菌株攻毒的新生仔猪进行口服治疗，治疗组仔猪服用效价为625和2500的抗体后全部存活，而对照组仔猪死亡率超过80％。 含有K88菌毛的ETEC是引起仔猪腹泻最主要的病原菌（Mmpwht等，1999）。在 K88＋ E．coli中，菌毛约占细菌蛋白质的 1％（Middledorp等，1981）。 Jin等（1998）将一种 K88+ ETEC地方株培养后，提取和纯化菌毛，将菌毛蛋白液（0．3mg/mL）与等量弗氏完全佐剂、弗氏不完全性剂充分乳化免疫蛋鸡，收集高免卵黄井喷雾干燥制成卵黄抗体粉，体外试验表明，该卵黄抗体粉能阻碍K88+ ETEC粘附到猪小肠粘膜上，而且能迅速与E．coli菌株结合，15 min即可使仔猪获得最大程度的免疫保护。Mapllwht等（1999）在此基础上，采用同一抗原免疫母鸡后获得抗K88菌毛的卵黄抗体，用于治疗 K88+ ETEC攻毒的新生（3日龄）和断奶后（对日龄府猪，结果表明，新生仔猪用卵黄抗体治疗后24h内均被治愈，而用安慰剂（不含K88抗体的卵黄粉）治疗的仔猪继续腹泻死亡率达62．5％；断奶仔猪饲喂卵黄抗体后仅出现短暂腹泻，未出现死亡病例且体重明显增加，而对照组出现严重腹泻和脱水症状，且48 h内即有仔猪死亡。在商业性猪场的饲粮中添加抗K88、K99菌毛的卵黄抗体，能降低早期断奶（14～18日龄）仔猪的腹泻发生率。 F18菌毛与断奶后仔猪的腹泻和水肿有关，现已知F18菌毛以F18ab小和F18ac。两种菌毛抗原变异体形式存在(Imberechts等，1997)。研究表明，F18ab菌毛是引起仔猪水肿的大肠杆菌的主要毒力因子之一，而F18ac菌毛是引起断奶仔猪腹泻的ETEC的一种菌毛抗原（严振龙等，200）。Zunigs等（1997）分别用 0．5 mgF18ab和 F18ac（干重）与等量含5 ％（v／v）Arlacel 80的乳化油充分乳化制备菌毛蛋白苗，免疫蛋鸡，制成特异性卵黄抗体粉，试验结果表明，经 F18ab+（或 F18ac+）E．coli攻毒的断奶仔猪饲喂相应抗体后，可获得完全保护。 2．3 菌体与菌毛抗原免疫效果的比较 以菌体为抗原制备菌体疫苗，制作虽然方便但免疫效果不如菌毛抗原制备的菌毛蛋白苗。肖驰等（1998）分别以ETEC菌毛和灭活菌体为抗原制备了抗K88、K99、987P和F41的卵黄抗体，结果表明两种卵黄抗体均有效，但菌毛蛋白苗免疫获得的抗体效价要高于菌体疫苗免疫获得的抗体效价。Kim等（1996）分别以ETEC的K88菌毛和减毒菌株作为抗原，对制备的卵黄抗体效价进行了比较（见表2），结果表明前者免疫得到的抗体效价明显高于后者，且抗体经纯化后效价显著提高。 表 2 IgY纯化前后卵黄中蛋白质的浓度及抗体效价 在卵黄中的浓渡（mg/kg）抗体效价 蛋白质（％） IgY（％） K88菌毛抗原免疫 纯化前的卵黄 446（100） 18（100） 8600 纯化后的卵黄 30（7） 14（81） 140000 减毒菌株免疫 纯化前的卵黄 539（100） 18（100） 1800 纯化后的卵黄 32（6） 15（81） 12000 注：资料来源于Kin等（1996）。 3 卵黄抗体抑制ETEC粘附的影响因素 Yokoyalna等（1992）应用抗K88、K99、987P特异性卵黄抗体治疗ETEC引起的新生仔猪腹泻，认为其治疗效果取决于抗体的剂量。试验结果表明，受到 K88+、K99+、987P+ ETEC攻毒的仔猪，用效价为156的相应抗体治疗时死亡率分别为29％、50％和40 ％，而用效价为625和2500的相应抗体治疗时仔猪全部存活。Zunisa等（1997）在研究抗F18菌毛的卵黄抗体时也得出了类似结论。 Jin等（1998）研究发现，卵黄抗体抑制ETEC粘附的影响因素是抗体的剂量和ETEC的浓度。小肠内所含抗体必须达到一定剂量才能阻止E．coli粘附到小肠粘膜上皮细胞的受体上。K88+ E．coli为 109 cfu（colony－ forming units）／mL时，稀释50和100倍的卵黄抗体对E．coli均有很强的抑制能力（粘附＜6％）；而K88+E．coli为1010Cfu／mL时，稀释100倍的卵黄抗体不能有效阻止E．coli粘附到肠粘膜上。Mndt等（1999）研究表明，采用卵黄抗体进行治疗应具有连续性，例如：每只仔猪每天饲喂1.5g的卵黄抗体能有效防治 1010 cfu/fmL ETEC引起的腹泻，在饲粮中添加0．2 ％的卵黄抗体可预防商业性猪场中仔猪腹泻。 4 展望 用特异性卵黄抗体防治仔猪大肠杆菌性腹泻，不会影响肠道正常菌群的生长繁殖，不存在抗药性和药物残留问题，同时也避免了怀孕母猪因注射疫苗引起的应激反应或仔猪母源抗体水平不足而导致的免疫丧失等问题，是一种安全高效的生物防治制剂，具有广阔的应用前景。