高温下清凉冲剂对鸡免疫器官中CD4+、CD8+T细胞数量影响的动态观察

貔貅

摘要目的：旨在通过研究清凉冲剂对鸡免疫器官中CD4+、CD8+T细胞含量的动态变化影响，探讨其在高温状态下对机体细胞免疫机能的作用效果，为研究清凉冲剂的药理作用提供理论依据。方法：108只农大3号35日龄公雏，随机分为3组，每组36只鸡，分别为常温对照组、高温对照组和高温用药组，用药组饲喂中药煎剂（浓度为1g/ml），喂药量与饲料量比为1：1000。在实验的第1、4、8、10天各组剖杀5只，分别采取胸腺、脾脏、法氏囊，利用免疫组化方法测定各免疫器官中CD4+、CD8+T细胞含量。结果：在高温过程中，用药组免疫器官中CD4+、CD8+T细胞水平均高于高温对照组，且以第8天最明显，差异显著或极显著。结论：清凉冲剂可以提高高温下鸡免疫器官中CD4+、CD8+T细胞的含量，表明清凉冲剂在高温环境下可以有效增强鸡的细胞免疫水平。
关键词清凉冲剂 CD4+ CD8+T 细胞免疫免疫组化

Dynamic Effect of Qingliang Decoction to CD4+ and CD8+T cell Average Positive Rate in the Immune Organs of Chicken Under Heat-Stress

Li xinguo1,2Xu jianqin3Hu yanxin3 Xu guangke1,2 Liu fenghua2

（1,Xinjiang Agricultural University, Xinjiang 830052; 2Beijing Agricultural College, Beijing 102206;

3,China Agricultural University, Beijing 100094）

AbstractThe aim of this experiment was to study the effects of Qingliang decoction through detecting the average positive rate of CD4+、CD8+T in the immune organs of chicken under high temperature. One hundred and eight Nongda 1 male chicken were randomly divided into 3 groups. It included of two controls without the decoction under normal and high temperature; and another treatment toke orally Qingliang decoction (0.1% of ration) in water under high temperature. Then the thymu, spleen, and bursal from each group were collected to detect the average positive rate of CD4+、CD8+ T－cell by immunohistochemistry and Motic image analyzing system. The results showed that the treatment with Qingliang decoction under high temperature increased gradually during the experiment period. It indicates that the Qingliang decoction may increase the average positive rate of CD4+、CD8+T-cell in immune organs under the heat-stress, improve the immune function.
Key WordQingliang decoction, CD4+,CD8+, Cell immune, Immunohistochemisty
    高温影响肉鸡的生长发育及生产性能，同时对机体的免疫机能产生很大影响，是诱发疫病流行的重要应激因素之一[1]。大量实验证明，热应激是通过作用于下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴促使糖皮质激素分泌，从而抑制机体的体液免疫和细胞免疫[2] [3]。机体的细胞免疫主要由T淋巴细胞介导来完成，根据其表面标志可将其分为两大类，即CD4+、CD8+T淋巴细胞，是T淋巴细胞的表面标志[4]。本实验拟通过对免疫器官中成熟T细胞，即CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量动态变化为指标，探讨在高温环境下清凉冲剂对鸡细胞免疫功能的影响，为清凉冲剂的开发奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
试验动物：农大3号35日龄公雏108只，购自北京昌平区试验鸡场。
中药清凉冲剂：由石膏(Gypsum Fibrosum)、藿香(Herba Agastachis)、苍术(RhizomaAtractylodis)、黄柏(Cortex Phellodendri)按等比例组成。
仪器及试剂：鼠抗鸡CD4+、CD8+单抗，Southern Biotechnology,Inc产品；HistostainTM-Plus Kits:ZYMED公司SP-9002免疫组化染色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；DABKit:显色剂，美国ZYMED公司产品（北京中杉金桥生物技术有限公司）；BH2 Olympus生物显微镜；AO820型切片机（Amersham optical）；Motic病理图像分析系统3.0
1.2试验方法

1.2.1分组试验从35日龄起至45日龄，试验期10天。随机平均分为3组，分别为常温对照组、高温对照组、高温用药组，每组36只鸡。

表1：试验分组

table1:the grouping ofexperimentation

常温对照组（22℃） normal temperature control	高温对照组（26～39℃） high temperature control（26～39℃）
常温对照组 normal temperature control	高温对照组 high temperature control	高温用药组 group 1

1.2.2人工气候舱温度曲线设计：（见图1）

1.2.3饲养管理实验动物饲喂北京震亚饲料厂生产的蛋鸡全价料，高温用药组饲喂中药清凉冲剂，喂药量与饲料量比为1：1000；对照组自由采食，进入人工气候仓适应3天后开始热应激，共10天。24小时循环变温。变温曲线见图1。常温组始终保持22℃。

1.2.4采样及切片制备各组分别于热应激第1、4、8、10天高温结束后随机选取5只鸡剖杀，分别采取脾脏、胸腺、法氏囊，用生理盐水冲洗干净并及时置于4%甲醛溶液中固定，常规石蜡切片，免疫组化染色，使用Motic病理图像分析系统照相并进行平均阳性率的灰度分析。

平均阳性率灰度分析方法如下：

1.3 试验数据处理方法数据使用DPS3.01数据处理系统进行平均数、方差分析。

2 结果

2.1高温下清凉冲剂对脾脏中CD4+、CD8+T细胞数量影响的动态观察（表2）

表2高温下清凉冲剂对鸡脾脏中CD4+、CD8+T细胞数量的影响(,n=5)

Table2. Effect of Qingliang decoction tothe average positive rate of CD4+、CD8+Tin
the spleen ofchicken under heat-stress单位（unit）：%

脾脏		第1天（1stday）	第4天（4thday）	第8天（8thday）	第10天（10thdya）
常温对照组 normal control	CD4+T	45.476±0.514	46.105±0.358	45.273±0.462	45.539±0.524
	CD8+T	35.476±1.492	35.803±0.487	34.749±0.348	35.037±0.378
高温对照组 high control	CD4+T	27.829±0.687＃＃	32.787±0.629＃＃	33.724±0.842＃＃	34.69±0.529＃＃
	CD8+T	24.235±0.761＃＃	28.352±1.237＃＃	28.365±0.328＃＃	30.639±0.125＃＃
高温用药组 drug group	CD4+T	28.451±0.542	33.161±0.237	44.256±0.628**	43.635±0.347**
	CD8+T	25.198±0.328	29.152±1.028	34.265±0.349**	35.195±0.529**

（＃P<0.05,＃＃ P<0.01，与常温对照组比较；* P<0.05, ** P<0.01,与高温对照组比较）

（＃P<0.05,＃＃ P<0.01,compared with the normal control; * P<0.05, ** P<0.01,compared with the high control）

    从表2中可以看出，常温对照组中CD4+、CD8+T细胞量保持一较稳定状态；高温对照组中虽然呈现一上升的趋势，但其含量远低于常温对照组，且各天差异都极显著（P<0.01）；高温用药组也呈现一上升的趋势，各天均高于高温对照组，与高温对照组相比较，第8、10天差异极显著（P<0.01）。

2.2高温下清凉冲剂对胸腺中CD4+、CD8+T细胞数量影响的动态观察（表3）

表3高温下清凉冲剂对鸡胸腺中CD4+、CD8+T细胞数量的影响(,n=5)

Table3. Effect of Qingliang decoction tothe average positive rate of CD4+、CD8+Tin the thymus of

chicken under heat-stress单位（unit）：%

胸腺		第1天（1stday）	第4天（4thday）	第8天（8thday）	第10天（10thdya）
常温对照组 normal control	CD4+T	43.473±0.286	42.827±0.624	43.193±0.318	43.718±0.831
	CD8+T	30.589±0.134	31.257±0.825	31.029±1.05	31.729±1.27
高温对照组 high control	CD4+T	29.784±1.52＃＃	34.627±0.516＃＃	34.682±0.642＃＃	36.572±0.487＃＃
	CD8+T	20.563±1.06＃＃	22.365±0.457＃＃	25.369±0.189＃＃	26.321±0.382＃＃
高温用药组 drug group	CD4+T	30.211±0.854	35.478±1.31	41.256±0.628**	42.635±0.649**
	CD8+T	21.152±0.482	23.258±0.458	30.236±0.492**	30.365±0.584**

（＃P<0.05,＃＃ P<0.01，与常温对照组比较；* P<0.05, ** P<0.01,与高温对照组比较）

（＃P<0.05,＃＃ P<0.01,compared with the normal control; * P<0.05, ** P<0.01,compared with the high control）

    从表3中可以看出，常温对照组中CD4+、CD8+T细胞含量保持一较稳定状态；高温对照组中虽然呈现一上升的趋势，但其含量远低于常温对照组，且各天差异都极显著（P<0.01）；高温用药组也呈现一上升的趋势，各天均高于高温对照组，于第8天达到最大差异值6.574、4.867，与高温对照组相比较，第8、10天差异极显著（P<0.01）。

2.3高温下清凉冲剂对法氏囊中CD4+、CD8+T细胞数量影响的动态观察（表4）

表4高温下清凉冲剂对鸡法氏囊中CD4+、CD8+T细胞数量的影响(,n=5)

Table4. Effect of Qingliang decoction tothe average positive rate of CD4+、CD8+Tin the bursa of

chicken under heat-stress单位（unit）：%

法氏囊		第1天（1stday）	第4天（4thday）	第8天（8thday）	第10天（10thdya）
常温对照组 normal control	CD4+T	28.4±0.567	28.647±0.927	28.516±0.634	28.459±0.260
	CD8+T	34.052±0.478	34.374±0.305	33.746±0.286	34.827±0.542
高温对照组 high control	CD4+T	14.876±0.371＃＃	23.765±0.674＃＃	25.298±0.548＃＃	23.685±0.628＃＃
	CD8+T	24.852±0.492＃＃	28.689±0.255＃＃	29.302±0.347＃＃	29.624±0.127＃＃
高温用药组 drug group	CD4+T	15.361±0.167	24.345±0.329	28.055±0.274**	25.797±0.561**
	CD8+T	25.161±0.682	38.945±0.286	34.105±0.821**	33.797±0.319**

（＃P<0.05,＃＃ P<0.01，与常温对照组比较；* P<0.05, ** P<0.01,与高温对照组比较）

（＃P<0.05,＃＃ P<0.01,compared with the normal control; * P<0.05, ** P<0.01,compared with the high control）

    从表4中可以看出，常温对照组中CD4+、CD8+T细胞含量保持一较稳定状态；高温对照组中虽然呈现一上升的趋势，但其含量远低于常温对照组，且各天差异都极显著（P<0.01）；高温用药组也呈现一上升的趋势，各天均高于高温对照组，于第8天达到最大差异值2.757、4.853，与高温对照组相比较，第8、10天差异极显著（P<0.01）。
3 讨论与结论
    CD4+、CD8+是相互关联、但意义不同的2个分子，是T细胞亚群的表面标志。表达CD4+的主要是辅助性T细胞，表达CD8+的主要是细胞毒性T细胞。CD4+和CD8+分子可增强CD3-TCR对MHC抗原的亲和力，并有助于激活信号的传递。CD4+分子增强对MHCⅡ类抗原的结合，CD8+分子则增强对MHCⅠ类抗原的结合[5]。CD4+T淋巴细胞作为调节细胞，主要是启动免疫应答和控制初次感染；而CD8+T淋巴细胞作为一种效应细胞，则是抵抗再感染的主力。二者分工不同，但又密不可分。通过释放各种细胞因子，相互促进，相互协调，共同完成抗感染作用。Gazziindlli(1999)也证实了CD4+和CD8+T淋巴细胞在抵抗感染中的协同作用[6]。Lisa,Trout等人试验也说明，CD4+、CD8+T淋巴细胞在细胞免疫中起主要作用[7，8]。故可通过对CD4+、CD8+T淋巴细胞数量多少的测定来判定机体的细胞免疫水平。
    胸腺是机体重要的中枢免疫器官之一， T淋巴细胞在胸腺中成熟，获得其功能及学习识别自我，完成T淋巴细胞的阳性选择(识别抗原/MHC的克隆增殖,成熟并移行至周围)和阴性选择(排除能将自身抗原作为异物起反应的克隆)的双重功能。并决定外周免疫器官的发育。脾脏是最大的外周免疫器官，也是发生免疫反应的主要场所。法氏囊是禽类特有的中枢免疫器官，是B细胞繁殖分化的主要场所，但同时它还作为外周淋巴器官，捕捉抗原和合成某些抗体，存在少量的T淋巴细胞[9]。
    从试验结果数据看，高温环境明显对鸡各免疫器官中CD4+、CD8+T淋巴细胞具有抑制作用，高温对照组明显低于常温对照组，各天差异性都极显著。清凉冲剂中君药石膏在20世纪80年代前主要通过退热作用，探讨其作用机制。在近年的研究中发现，石膏亦能够非特异性增强动物细胞及体液免疫水平[10，11，12]。本实验中高温用药组各免疫器官中CD4+、CD8+T淋巴细胞数量高于高温对照组而低于常温对照组，至高温第8、10天时基本接近常温对照组，其中以第8天差异性最显著，也说明了以石膏为主的中药复方对提高机体免疫器官中CD4+、CD8+T淋巴细胞具有很好的促进作用，能促使机体在极端高温应激中迅速恢复稳态。
    综上所述，高温环境对鸡免疫器官中CD4+、CD8+T淋巴细胞数量具有抑制作用，从而降低机体细胞免疫水平。复方清凉冲剂在高温环境下对鸡免疫器官中的CD4+、CD8+T细胞数量具有促进作用，表明了清凉冲剂可以在高温环境下增强机体细胞免疫功能。