小檗碱对内毒素致肠粘膜微血管内皮细胞损伤的保护作用

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[url=]小檗碱对内毒素致肠粘膜微血管内皮细胞损伤的保护作用[/url] 段慧琴1 ，许剑琴1，张永东1，索占伟2，穆祥2*，乔建1* （1.中国农业大学动物医学院，北京 100094；2. 北京农学院动科系，农业应用新技术北京市重点实验室，北京 102206）

[摘要] 目的：探讨小檗碱对细菌脂多糖（LPS）致大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(RIMEC)损伤的保护作用。方法：以原代培养的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞 (RIMEC)为实验模型, 10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml小檗碱预孵2h后加入1μg/ml 的LPS 刺激24h 检测不同时间点细胞培养上清夜中一氧化氮（NO）的水平。NO测定采用硝酸酶还原法。结果：小檗碱在12h、24h时使活化的内皮细胞分泌NO下降，与LPS比较差异极显著（P<0.05），对内毒素引起的NO升高有明显下调作用。结论：降低NO分泌，保护LPS引起的血管内皮损伤是小檗碱发挥其抗炎活性的机制之一。 [关键词]：小檗碱；NO；LPS；微血管内皮细胞 中图分类号：文献标识码：   小檗碱属异喹啉类生物碱，也称黄连素，常用其盐酸盐，为毛莨科黄连属植物黄连、黄柏的根茎提取的主要成分，临床上用于治疗菌痢、肠炎、急性扁桃体炎和急性支气管炎等多种疾患[ 1]。关于小檗碱的抗炎机制目前尚不清楚。为了阐明其的抗炎机制，本试验采用体外细胞培养技术，观察了小檗碱对肠粘膜微血管内皮细胞分泌NO的影响，以期进一步揭示其临床药理作用。 1.材料和方法 1.1主要试剂DMEM培养基、优级胎牛血清(购自Gibco公司)、LPS ( E.coli O55:B5,购自sigma公司)、NO试剂盒 ((购自晶美生物工程有限公司)、小檗碱 (标准品，购自中国药品生物鉴定所)。 1.2 大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分离培养鼠肠黏膜微血管内皮细胞（RIMEC）分离培养见以前所述【1】简述如下：选用出生24小时之内SD大鼠乳鼠，用外科手术方法获得空肠，Dhank’s液冲洗，纵向切开，冲洗，剪成小段，吹打数次。调整浓度接种于6孔细胞培养板中，基础培养基用DMEM培养基，补充15％胎牛血清、100 U/ ml青霉素、10μg/ mL链霉素，置5%ＣＯ2培养箱培养，2-3ｄ换液1次。细胞达到80%融合生长时即行传代。倒置显微镜下,细胞呈典型的铺路石状相嵌排列,无重叠生长现象。免疫荧光法检测到内皮细胞Ⅷ因子相关抗原阳性。 1.3实验细胞准备及处理实验使用第5代细胞。将融合生长的内皮细胞以0.25％胰蛋白酶消化，细胞悬液接种于96孔细胞培养板，细胞密度5×107 cells/L，每孔500μl，置5%CO2培养箱培养。待细胞融合成单层细胞，开始实验。分组：（1）对照组（加含2％血清的维持培养基）；（2）LPS组（1μg/ml LPS）（3）小檗碱组＋LPS（分别用10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml小檗碱预孵2h后加入1μg/ml 的LPS）（4）小檗碱组（10μg/ml 小檗碱），每组设复孔6个，分别于刺激后3、6、12、24h 收集上清液，贮存于-20℃冰箱内待测。 1.4 .细胞上清液内NO含量测定采用硝酸还原酶法。以总硝酸盐(NOX)含量表示NO浓度。测试方法参照试剂盒说明书。 1.5统计学处理各组数据以ｘ±ｓ表示，组间差异显著性判定采用ｔ检验。 2.结果 2.1 小檗碱对RIMEC分泌NO的影响本试验利用还原酶法检测了小檗碱对RIMECs 分泌NO的影响。结果显示，10 μg/ml小檗碱在3h、6h内可以促进NO分泌，作用12h后对NO分泌影响减弱，24h时对正常NO分泌无影响，与正常组比较差异不显著（见表1、图1）。 2.2小檗碱对LPS诱导的RIMEC NO分泌增高的影响如表1、 图2所示，在3h、和6h时，10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL的小檗碱对LPS诱导的NO 分泌升高均没有影响；在12h和24h时，10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL的小檗碱显著降低NO分泌水平，可以下调LPS引起的NO的分泌升高，基本恢复至正常水平，与LPS组比较差异极显著，但没有剂量依赖性。 表1 不同浓度小檗碱在不同时间点对RIMECs分泌NO的影响 (ｎ=6,ｘ±ｓμmol/l) Table1.1: The effect of various concentrations ofBerberine on NO production in RIMECs (ｎ=6,ｘ±ｓ) Group 3h 6h 12h 24h Control 24.18±1.87 21.2±1.15 21.33±3.52 23.1±0.39 LPS (1 μg/ml) 27.20±0.58* 28.86±1.26* 46.75±0.56** 58.53±0.66** Berberine 1 μg/ml +LPS Berberine 5 μg/ml +LPS 30.34±0.79 26.81±1.06 26.55±2.69▲▲ 19.65±3.56 34.26±1.3 29.68±1.22 25.52±7.29▲▲ 19.5±0.26 Berberine 10 μg/ml +LPS 29.82±1.15 26.12±2.57 22.16±0.9▲▲ 21.89±0.52 Berberine 10 μg/ml 32.16±1.25** 30.90±2.28 25.46±2.46 24.11±1.01 *:（P<0.05） **:（P<0.01）：vs normal group,▲: P<0.05, ▲▲: P<0.01 vs LPS group 3.讨论     内皮细胞不仅是血液和组织之间的重要屏障，而且在许多病理生理过程（包括炎症）中起着重要的作用【2】。越来越多的研究证明，血管内皮细胞受损是内毒素性休克、全身性炎症反应综合症以及多器官功能障碍的基本原因【3】。不同来源的微血管内皮细胞在形态、结构、功能上存在着一定的差异性[4]。肠粘膜微血管内皮细胞是内毒素作用的主要靶点之一，在大肠杆菌性肠炎及其引起的菌血症和毒血症的发生和发展中起着重要的作用。利用体外培养的肠粘膜微血管内皮细胞可以直接观察药物对内皮细胞的调控作用，从而在细胞水平对机理进行深入研究。     NO在许多生理和病理生理状态中具有递质、信使和细胞功能调节因子的功能。研究认为急慢性炎症的发生均与NO有关系。在炎症反应中组织中诱生型NO合酶(iNOS)被诱导生成，产生大量NO，促进炎症反应，包括使血管舒张，形成水肿和局部红斑，增加炎性渗出，细胞毒性作用以及细胞因子依赖过程的介导作用，促进败血症的发展等。这也暗示了能够抑制LPS引起的NO分泌增加的制剂对控制炎症的发生发展具有潜在的的治疗价值。     小檗碱具有在人医和兽医临床上具有广泛应用价值。印度Dutta等在60年代发现小檗碱可以抑制幼兔的霍乱弧菌的传染[5]。从那以后，印度科学家对该药进行了深入的研究，并发现了小檗碱可以抑制其他的细菌的传染（包括霍乱弧菌），对原生动物，真菌和利什曼原虫均有抑制作用，并有报道发现用小檗碱治疗霍乱[6]引起急性腹泻。小檗碱对大肠杆菌耐热肠毒素和不耐热肠毒素引起的幼兔腹泻具有显著疗效[7]。但对其抗炎机理的研究报道较少。郝钰等[8]研究发现小檗碱能下调IL-1、TNF诱导的人脐静脉内皮细胞粘附分子ICAM-1的表达增强。吕燕宁等[9]研究发现小檗碱1.5mg/mL对二硝基氟苯(DN FB) 所致的小鼠DTH 有抑制作用, 其机制可能是抑制了IFN-C, IL-1, TN F-A, IL-2 等因子的产生和分泌, 从而抑制免疫反应, 减轻炎症损伤。     本试验结果发现小檗碱对LPS诱导的肠粘膜微血管内皮细胞NO分泌增加有明显的抑制作用。小檗碱对内皮细胞分泌NO的影响反应较慢，在12h和24h时作用较强，能够抑制过多的NO分泌。在12h时，5、10 μg/ml的小檗碱可以抑制LPS引起的NO增加，24h时1、5、10 μg/ml的小檗碱均可以抑制LPS引起的NO增加，三个浓度组之间没有明显的剂量依赖性。结果提示小檗碱可以通过降低NO的分泌来发挥其抗炎活性，改善LPS引起的内皮细胞损伤及循环障碍。     试验还发现小檗碱对静息的肠粘膜微血管内皮细胞分泌功能也有影响，3h、6h时使NO分泌升高，12h后又逐渐恢复正常。提示小檗碱在生理状态下可能有舒张血管的效应，而且存在自我调节机制，这也从一方面证实了血管内皮释放NO 是小檗碱产生血管松弛作用的内皮依赖性机制[10]。     关于小檗碱在病理生理条件下调节肠粘膜微血管内皮细胞分泌NO的的分子机制还需从小檗碱对eNOS和iNOS的活性及其mRNA表达的调控方面进行深入研究。