白头翁素对LT致肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO升高的影响

貔貅

摘要：为了探讨白头翁在治疗细菌性痢疾方面的药理机制，通过体外培养肠黏膜微血管内皮细胞，采用硝酸还原酶法检测各试验组细胞上清液中NO含量，研究了白头翁素对正常培养的肠黏膜微血管内皮细胞和LT刺激后的肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO的影响。研究结果显示白头翁素对正常肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO无明显影响，但可显著抑制LT引起的肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO升高。表明白头翁素抑制LT刺激肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO，是白头翁素的重要药理机制。
关键词：微血管内皮细胞；肠黏膜；LT；白头翁素；NO
    白头翁作为治疗菌痢的要药，其主要成分是白头翁素。目前，对白头翁素药理机制的研究并不多见，一般认为主要在于抑菌[1]，对于其它的药理作用尚不得而知。越来越多的研究表明，细菌毒素是引起腹泻的罪魁祸首，而细菌毒素作用的主要靶细胞是肠黏膜微血管内皮细胞[2]。因此，阻断细菌毒素对肠黏膜微血管内皮细胞的损伤，为抗细菌病药物的研究提供了新的思路和方法。热敏肠毒素（LT）是产毒素性大肠杆菌释放的主要毒素，可直接导致腹泻。本试验在建立LT引起肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO升高病理模型的基础上，研究了白头翁素对其影响，以进一步阐明白头翁素的抗腹泻机制。
1材料与方法
1.1主要材料与试剂
肠黏膜微血管内皮细胞：本实验室培养的第八代大鼠肠黏膜微血管内皮细胞[3]。
完全培养基：在DMEM培养液中按比例加入以下成份：15% FBS（Hyclone）、0.584mg/ml谷氨酰胺（Sigma）、1×105U/L注射用青霉素（华北制药股份有限公司）、0.1g/L注射用链霉素（华北制药股份有限公司）。
维持培养基：添加5％FBS，其它成份同完全培养基。
LT ：由北京农学院微生物实验室制备、鉴定[4]。
白头翁素：购自天津中医药研究所。
NO检测试剂盒：购自深圳晶美生物工程公司。
1.2试验方法
1.2.1肠黏膜微血管内皮细胞传代培养：

    选取第七代肠黏膜微血管内皮细胞，进行传代，平均接种于48孔培养板内，静止培养。细胞定时计数，待数量增至1.0×105时，选取40孔细胞用于试验。

1.2.2细胞分组：
将细胞按以下方案分为四组。
对照组：用维持培养基培养；
LT组：用含有10mg/ml LT的维持培养基培养；
白头翁素组：用含有5mg /ml白头翁素的维持培养基培养；
LT＋白头翁素组：用含有10mg/ml LT的维持培养基培养1h后，再添加白头翁素继续培养。
1.2.3样品采集和NO测定
    各组细胞分别培养3h、6h后，依次收集培养上清液（每组收集5孔），3000rp/m离心10min后，分别收集于小离心管中。按NO检测试剂盒（硝酸还原酶法）操作说明，于530nm处检测各样品OD值，按公式计算NO水平。
1.3数据统计学处理    以平均数 ± 标准差表示，采用t检验进行显著性分析。
2 结果与分析
    各组细胞分泌NO的量见附表，由表可知：（1）在3h和6h内，LT组细胞分泌NO量均极显著高于对照组；（2）在3h和6h内，白头翁素组细胞分泌NO的量与对照组之间差异均不显著；（3）在3h和6h内，LT＋白头翁素组细胞分泌NO量均极显著低于LT组。
    以上结果表明：10mg/ml LT可刺激肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO升高；10mg/ml白头翁素对正常培养的肠黏膜微血管内皮细胞NO的分泌无明显影响；5mg /ml白头翁素可显著抑制LT引起的肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO升高。

附表.白头翁素对LT刺激肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO的影响（±sμmol/L ，n=5）

Table: The effect of anemones on the level of NO in the rat intestinal mucous microvascular endothelial cells exposed under LT. （±sμmol/L ，n=5）

组别	剂量 mg/ml	3hNO μmol/L	6hNO μmol/L
对照组	0	21.43±1.34	16.60±1.26
LT组 白头翁素组 LT＋白头翁素组	10 5 10＋5	26.68±1.18* 21.22±2.18** 17.54±1.47Δ	34.77±1.43* 16.46±1.43** 16.39±1.01Δ

（在同一时间段，与对照组比较 *P<0.01，**P>0.05，与LT组比较ΔP<0.01。）
3．讨论：
    LT是产毒素性大肠杆菌的主要毒力因子，以往的研究都集中于LT对肠黏膜上皮细胞功能的影响，并认为上皮细胞是LT的特异性靶细胞[5]。随着对内皮细胞功能的不断深入，人们开始逐渐认识到肠黏膜微血管内皮细胞在细菌毒素引起的肠道疾病中起十分重要的作用。有人认为，由细菌毒素引起的肠道微血管内皮细胞反应异常，如微血管通透性增加、中性粒细胞聚集及微血管收缩等，是导致肠炎的重要致病机制[6]。考虑到肠黏膜微血管紧接上皮细胞层，是循环系统的末端，其通透性升高是导致黏膜水肿和水盐流入肠腔的前提，因此，我们推测，肠毒素除了损伤肠黏膜上皮细胞，甚至更为重要的是损伤到肠黏膜内皮细胞，引起肠道通透性升高，从而导致腹泻。本试验结果LT能显著刺激肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO升高，结合NO的增加微血管通透性效应，证实了我们的观点。
    白头翁是治疗细菌性痢疾的重要中药，对其有效成分作用机理的研究无疑有助于临床用药。本试验调查了白头翁素对正常培养的肠黏膜微血管内皮细胞以及对LT刺激后的肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO的影响。结果表明，5mg /ml白头翁素对正常肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO无明显影响，但可抑制LT引起的肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO升高。推测这种抑制作用，可通过以下4种途径实现：①直接破坏LT的活性结构；②与LT竞争肠黏膜内皮细胞上的受体；③参与LT刺激肠黏膜微血管内皮细胞合成和分泌NO的中间过程；④直接影响NO的分泌。从LT对正常培养肠黏膜内皮细胞分泌NO无明显影响的结果，可以排除④的可能性，但确切的机制尚需进一步研究。据研究报道，NO可作为内皮细胞损伤的标志物[7]，因此可以推论，白头翁素对LT引起的肠黏膜微血管内皮细胞损伤具有保护作用。这对于防止肠黏膜微血管内皮细胞免受LT造成损伤和防治大肠杆菌病具有重要意义。