SLT-2e对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO的影响

貔貅

志贺样毒素Ⅱ型变异体（SLT-Ⅱe）是猪水肿病（ED）的主要致病因子[1]。目前的研究显示：SLT-Ⅱe的致病机制是通过对其靶细胞-——肠黏膜微血管内皮细胞的刺激，引发细胞分泌机能的改变，释放各种细胞因子影响细胞的正常形态和功能[2]。NO是血管内皮细胞产生的内皮衍生性舒张因子，具有抗血小板聚集和中性粒细胞黏附的作用，对机体的微循环发挥着重要的调节作用[ 3 ]。　　为了研究微血管内皮细胞在猪水肿病发病机制中的作用，本试验以大鼠肠黏膜微血管内皮细胞为介质，观察了SLT-Ⅱe对其分泌细胞因子NO的影响，旨在了解SLT-Ⅱe对肠黏膜微血管内皮细胞的损伤机制。
　　1材料与方法
　　1.1材料
DMEM（Gibico）；标准胎牛血清（Gibico）；SLT-Ⅱe液（扬州大学微生物实验室提供）；大鼠肠黏膜微血管内皮细胞（北京农学院实验室提供）；NO试剂盒（深圳晶美公司）。
　　1.2方法
　　1.2.1大鼠肠黏膜微血管内皮细胞传代培养
选取传至第10代的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞进行消化,所得细胞液用完全培养基稀释,将细胞密度调整到5×104 个?mL-1,充分混匀后接种至96孔的培养板中,每个孔接种0.2 mL，然后置入CO2 培养箱中静止培养48h。
　　1.2.2试验前细胞计数
培养48 h后，定时消化三孔细胞作计数，当细胞数量增至1 ×105 个?mL-1 时，用于试验。
　　1.2.3分组
将各孔细胞分为空白对照组、SLT-2e 1组、SLT-2e 2组、SLT-2e 3组，每孔设复孔3个，分别加入含0μg?mL-1、2μg?mL-1、10μg?mL-1、50μg?mL-1SLT-2e的DMEM维持培养基，置于CO2 培养箱中静置培养。
　　1.2.4取样
每组分6h、12h、18h、24h四个观测点，在各时间点取样测定细胞上清液中NO的含量。
　　1.2.5测定
NO的测定用硝酸还原酶法，按照试剂盒说明操作于530nm 处检测.
　　1.2.6数据统计
试验结果采用平均值±标准误表示，采用SPSS11.0统计软件处理，试验组间差异采用t检验法。
　　2结果
　　不同浓度SLT-2e对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞NO分泌的影响结果见表1。由表1可以看出，SLT-2e 1组（2μg?mL-1）在6 h、12 h、18 h和24 h时，NO的分泌量无显著变化；SLT-2e2组（10μg?mL-1）在12 h、18 h和24 h时，NO分泌量均显著或极显著升高；SLT-2e3组（50μg?mL-1）在各时间段均极现状升高，说明一定浓度的SLT-2e能够作用于微血管内皮细胞，使其分泌NO的量增加。
　　表1. 不同浓度SLT-2e对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞（RIMVECs）分泌NO的影响 (n＝3)

组别	6 h	12 h	18 h	24 h
空白对照组	9.58±0.87	11.29±3.68	12.05±171	11.10±1.44
SLT-2e 1组 (2μg?mL-1)	10.72±1.75	11.86±1.19	10.15±2.87	12.81±2.38
SLT-2e2组（10μg?mL-1）	11.10±3.15	17.40±1.32*	35.93±2.31**	36.11±2.50**
SLT-2e3组（50μg?mL-1）	19.31±4.03**	26.95±2.29**	24.28±4.67**	26.38±5.98**

　　**p＜0.01，*p＜0.05
　　3讨论
　　已有研究表明，猪水肿病的致病过程分为3 个阶段：（1）致猪水肿病大肠埃希菌感染易感猪；（2）细菌以其F18ab( F107) 菌毛黏附于小肠上皮细胞；（3）细菌在肠道内定居和增殖，产生志贺样毒素Ⅱ型变异体（SLT-Ⅱe）并被吸收，最终导致感染猪发病[4]。SLT-Ⅱe在本病的发生过程中起着重要作用，它可通过直接或间接的途径激活或损伤肠黏膜微血管内皮细胞，致其结构和功能发生变化，如血管的舒缩、黏附分子的表达以及屏障功能损伤等[5]。
NO是血管内皮细胞分泌的重要细胞因子之一，具有舒张血管的作用。一旦出现体内NO分泌不足或过量，都会对机体微循环造成严重损伤，进而引发各种疾病[6]。本试验结果表明，肠黏膜微血管内皮细胞在生理状态下也分泌一定量的NO，以维持微血管内皮细胞功能的稳定。于培养基中添加一定量的SLT-Ⅱe后，10μg?mL-1 和50μg?mL-1组在6-24 h时，NO分泌量均显著升高，表明SLT-Ⅱe能够作用于微血管内皮细胞，刺激其对NO的分泌量增加。NO是舒张血管物质，其含量的升高，将使血管舒张，血管间隙增加，血管内的液体成分更易于渗出到血管外，导致水肿的发生，这也证明产志贺样大肠杆菌引起水肿病的机理就是通过其分泌的SLT-Ⅱe作用于肠黏膜微血管内皮细胞，致使微血管内皮细胞对NO的分泌增加而发挥致病作用的。
　　从本试验的结果可以发现，浓度为50μg?mL-1 的SLT-2e作用于细胞后，NO的分泌量在6 h和12 h即显著高于10μg?mL-1组，而在18 h和24 h时，则显著低于，这可能是因为50μg?mL-1 浓度较高，作用于细胞后，在短时间内即导致其NO的分泌大量增加，但随着作用时间的延长，部分细胞因毒素的作用而死亡，因此在18 h和24 h时NO的分泌量反而较10μg?mL-1组为低。由试验结果还可以看出，2μg?mL-1组各时间段NO的分泌量始终处于一个比较恒定的水平，其原因可能于本组毒素浓度较低，对微血管内皮细胞的损伤较小或没有损伤有关。
　　综上所述，我们认为SLT-2e损伤肠黏膜微血管内皮细胞，使其NO分泌增加是仔猪水肿病发生的机制之一。