槐花水煎液抗SLT-Ⅱe致RIMMVECs损伤的保护效果研究

貔貅

　志贺样毒素Ⅱ型变异体(Shiga like toxin，SLT-Ⅱe）主要由出血性大肠杆菌(EHEC)产生，为猪水肿病的主要毒力因子。目前的研究表明，微血管内皮细胞上带有的SLT-Ⅱe特异性受体[2]，且SLT-Ⅱe能抑制大鼠肠黏膜微血管内皮细胞（rat intestinal mucosa microvascular endothelial cells, RIMMVECs）的增殖，并可对其造成一定损伤。本试验通过对不同浓度槐花水煎液单独及与SLT-Ⅱe共同作用后，RIMMVECs的增殖率及NO分泌量的观察，探讨中药抗SLT-Ⅱe的作用机理，为防治猪水肿病的中药筛选和中药抗细菌毒素的机理研究提供理论依据。　　1．材料与方法
　　1.1材料
　　DMEM（Gibico）；标准胎牛血清（Gibico）；SLT-Ⅱe液（扬州大学微生物实验室惠赠）；槐花（购自北京同仁堂药店）；大鼠肠粘膜微血管内皮细胞（北京农学院中兽医实验室提供）；NO试剂盒（深圳晶美）；噻唑蓝（MTT，Amresco）；二甲基亚砜（DMSO，Sigma）；所有试剂均经过0.22μm孔径的滤膜过滤除菌。
　　1.2仪器
　　培养板（Costar）；96孔酶标板（Costar）；CO2培养箱（Sanyo)；荧光倒置数码显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）；酶联免疫检测仪（BioRad）；分光光度计(Unico)
　　1.3方法
　　1.3.1细胞传代接种：选取第10代的细胞进行消化，所得细胞液用完全培养基稀释，将细胞密度调整到5×104 ?个/mL，充分混匀后接种至96孔细胞培养板中，每个孔接种200 μl，然后置入CO2 培养箱中静止培养48 h。
　　1.3.2 药液处理：精确称量干燥槐花100 g ，常法煎煮两次。经旋转蒸发仪浓缩成1︰1浓度的药液。4℃保存。使用前，用维持培养基稀释至所需浓度。
　　1.3.3 槐花对RIMMVECs的效用试验：细胞传代至96孔细胞培养板，37 ℃、CO2培养箱中静置培养，待细胞生长到80%铺满培养孔底壁，选取5组共25孔的细胞用于试验。吸弃原培养基，在各组中分别加入含100.0、10.0、1.0、0.1、0 mg/mL槐花的维持培养基200μl，记为槐花1组、槐花2组、槐花3组、槐花4组和空白组。37 ℃静置培养24 h后，将96孔细胞培养板置入CO2培养箱中，37 ℃静置培养24 h。吸出全部细胞培养液，3000 rpm离心10 min，将上清液移入新的小离心管中，封口，-20 ℃冰箱保存。依试剂盒说明书完成细胞上清液中NO的测定。在吸净细胞上清夜的各孔细胞中加入5 mg/mL的MTT 30 ml及150 ml的DMEM维持培养基，继续培养4 h后，轻轻吸弃孔内液体，每孔加入150 μl DMSO，37 ℃孵育30 min 以上，使细胞内结晶充分溶解，于酶标仪570 nm波长测定细胞增殖率（OD值）。
　　1.3.4 槐花抗SLT-Ⅱe对RIMMVECs损伤的作用试验：细胞处理同前，选取5组共25孔细胞进行试验，分别记为空白组、毒素组、毒素+槐花1组、毒素+槐花2组、毒素+槐花3组。各组加入含不同成分的维持培养基200 μl，各组所含毒素及槐花浓度如下：空白组：维持培养基；毒素组：维持培养基中SLT-Ⅱe 含量为10.0 μg/mL；毒素+槐花1组：维持培养基中含SLT-Ⅱe 10.0 μg/mL，槐花5.0 mg/mL；毒素+槐花2组：维持培养基中含SLT-Ⅱe 10.0 μg/mL，槐花0.5mg/mL；毒素+槐花3组：维持培养基中含SLT-Ⅱe 10.0 μg/mL，槐花0.05 mg/mL。增殖率及 NO分泌量的测定同上。
　　1.4数据统计
　　试验结果采用平均值±标准误表示，试验组间差异采用t检验法
　　2．结果
　　2.1 槐花对RIMMVECs的增殖效果试验
　　由表1可以看出，不同浓度槐花水煎液作用于RIMMVECs 24 h后，槐花1组（100 mg/ mL）、槐花2组（10 mg/ mL）、槐花3组（1 mg/ mL）OD值均小于空白组，且差异极显著，对RIMVECs增殖呈抑制作用，三组之间差异亦极显著。槐花4组（0.1 mg/ mL）OD值大于空白对照组，且差异极显著，表现出对RIMVECs的保护、增殖作用，增殖率达14.67%。

　　表1 槐花对RIMMVECs的增殖效果试验

组别	X ± S	增殖率%	统计结果
空白组	1.60±0.07	—	B? b
槐花1组	0.04±0.02	-97.81	E? e
槐花2组	0.70±0.08	-55.96	D? d
槐花3组	1.24±0.07	-22.49	B? b
槐花4组	1.83±0.08	14.67	A? a

　　注：各组间不含有相同大写字母表明差异极显著p＜0.01，各组间不含有相同小写字母表明差异显著p＜0.05
　　2.2 槐花对RIMMVECs分泌NO的影响
由表2可以看出，槐花1组与槐花2组对RIMVECs作用24h后，所测NO分泌量与空白对照组比较，差异极显著，与槐花其他两组比较差异极显著，二者之间差异亦极显著。槐花3组NO分泌量与空白对照组比较，无明显差异。槐花4组NO分泌量分泌与空白对照组比较，差异显著（P＜0.05）。但槐花3、4组间无明显差异。

表2? 槐花水煎液对RIMMVECs分泌NO的影响（X±S μmol/L，n = 5）组

组别	X ± S	统计结果
空白组	10.02±1.10	C?? d
槐花1组	66.01±2.32	A ??a
槐花2组	17.21±1.40	B?? b
槐花3组	12.02±1.80	C ?cd
槐花4组	12.50±1.64	C ??c

　　注:? 各组间不含有相同大写字母表明差异极显著P<0.01，各组间不含有相同小写字母表明差异显著P<0.05
　　2.3 槐花水煎液与SLT-Ⅱe共同作用对RIMMVECs增殖率的影响
　　由表3可以看出，当SLT-Ⅱe浓度为10 μg/mL时，毒素作用细胞24 h后，MTT法测细胞增殖率OD值低于空白对照组，二者相比较，差异极显著，其对细胞增殖抑制率达29.07%。对于槐花组，毒素+槐花1组OD值与空白对照组比较差异显著，与毒素组比较差异不显著。毒素+槐花2组与空白对照组比较差异不显著，与毒素组比较差异显著。毒素+槐花3组与空白对照组比较，差异显著，与毒素组比较差异极显著。槐花3个组OD值则随着槐花浓度增加呈现出先升高再降低的趋势。槐花三个组之间比较差异均极显著。其中只有毒素+槐花2组与槐花三个组比较无明显差异，其他两组均差异极显著。

表3 槐花水煎液与SLT-Ⅱe共同作用对RIMMVECs增殖率的影响

组别	X ± S	增殖率%	统计结果
空白组	2.40±0.10	0	A? ?a
毒素组	1.70±0.11	-29.07	C?? c
毒素+槐花1组	1.72±0.09	-28.39	C?? c
毒素+槐花2组	2.30±0.07	-4.20	A?? a
毒素+槐花3组	2.00±0.14	-16.60	B?? b

　　注:? 各组间不含有相同大写字母表明差异极显著P<0.01，各组间不含有相同小写字母表明差异显著P<0.05
　　2.3 槐花水煎液与SLT-Ⅱe共同作用对RIMMVECs分泌NO的影响
　　由表4和图4可以看出，当SLT-Ⅱe浓度为10 μg/mL时，毒素作用RIMMVECs 24 h后，细胞上清液中NO的分泌量与空白对照组比较增加明显，且差异极显著。对于槐花组，毒素+槐花1组、毒素+槐花2组与空白组比较差异极显著，而与毒素组比较无显著差异。毒素+槐花3组与空白组比较差异不显著，但与毒素组比较差异极显著。槐花组相应的NO分泌量随槐花浓度的降低而逐渐降低，三个组之间，毒素+槐花1组与毒素+槐花2组比较无显著差异，与毒素+槐花3组比较差异显著，毒素+槐花2组与毒素+槐花3组间比较差异显著。

表4 槐花水煎液与SLT-Ⅱe共同作用对RIMMVECs分泌NO的影响

组别	X ± S	统计结果
空白组	14.20±2.31	C ???d
毒素组	24.32±4.16	A ???a
毒素+槐花1组	22.95±1.73	A ???ab
毒素+槐花2组	20.57±1.77	AB ?bc
毒素+槐花3组	17.95±2.19	BC ??d

　　3．分析与讨论
　　传统中(兽)医的观点认为，猪水肿病的病因内为高蛋白饲料完谷不化，郁积为热毒；外来六淫之邪夹攻，湿毒热邪无以发泄所致[2]。槐花药性微寒、味苦、归肝、大肠经。具有凉血、止血的功效,用于便血、痔血、血痢、崩漏等 [3]。通过本试验中槐花对RIMMVECs的效用试验的结果可以看出，槐花水煎液对RIMMVECs具有较强的毒性作用，在24 h内，1.0 mg/mL以上的槐花剂量组均可以明显抑制RIMMVECs的增殖，直到浓度为0.1 mg/mL才表现出对细胞的增殖作用。而槐花各组对RIMMVECs分泌NO均高于空白组，但由于槐花水煎液本身具有一定的色泽影响，故排除槐花1组、槐花2组。而从槐花3组、槐花4组的结果仍略高于空白对照组，结合槐花组对细胞增殖率的试验结果，可以推测槐花对细胞NO的分泌呈微上调的趋势。而从槐花水煎液与SLT-Ⅱe共同作用RIMMVECs后细胞增殖率的结果可以看出，在浓度为0.5 mg/mL和0.05 mg/mL时，槐花水煎液明显的改善了因SLT-Ⅱe作用而导致的细胞增殖抑制，表明槐花水煎液可以起到保护内皮细胞的作用，其中0.5 mg/mL浓度组效果更好。而5.0mg/mL浓度组的细胞增殖率较低则很可能是由于槐花在该浓度下仍具有细胞毒性所致。而从NO分泌的角度来看，毒素+槐花3组表现出明显的抑制SLT-Ⅱe作用后细胞分泌NO增加的作用。槐花对NO分泌的调控与细胞增殖结果并不完全一致，其对抗SLT-Ⅱe、保护RIMMVECs的作用机理尚有待进一步研究。