清凉冲剂对鸡免疫功能的影响

貔貅

清凉冲剂对鸡免疫功能的影响 胡艳欣1佘锐萍1马卫明4肖冲2王占赫1许剑琴1刘凤华3 *     （1 中国农业大学动物医学院北京 100094；2中国农业大学生物学院北京 100094；3北京农学院北京 102206 ；4 山东农业大学动物科技学院山东泰安 271018)

摘要：本实验所采用的清凉冲剂，是以石膏为主要成分的中药复方。实验动物选择体重基本一致的农大三号雏鸡60只，随机平均分为2组。实验从第7日龄起，至49日龄时止，周期共计6周。其中实验组饲喂中药煎剂（浓度为1g/ml），喂药量与饲料量比为1：1000；对照组不喂药，两组均正常饮水。在第7，21，35，49日龄时，两组分别剖杀5只，取胸腺、法氏囊、脾脏等免疫器官，称量并计算免疫器官指数；每周进行心脏采血,用血凝抑制法(HI)测定各组血清NDV抗体水平；采用腹腔巨噬细胞功能测定法，计算其吞噬百分率和吞噬指数。实验结果显示：与对照组相比，免疫器官指数、NDV抗体水平以及腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数各项指标实验组均明显高于对照组(P<0.05或P<0.01)。说明清凉冲剂可以有效增强鸡的免疫功能。 关键词：清凉冲剂免疫功能鸡 Effect of Qingliang Chinese-Herb decoctionon chickenimmunological function HU yan-xin 1,SHE rui-ping1, MA wei-ming4,XIAO Chong2 , Wang zhan-he1,Xu jian-qin1,LIU feng-hua3 (1 College of Veterinary Medicine , China Agricultural University , Beijing 100094 ,2 College of Biology, China Agricultural University , Beijing 100094 ,3Beijing Agricultural College ,Beijing 102206,China 4 Shandong Agricultural University,taian,271018 ) ［Abstract］Sixty healthy seven-day-old layers were divided into two groups at random , thirty for each.. Qingliang Chinese-Herb decoction were orally administered to chicken of Group Ⅰ. Group II is the control group ..At the age of 7, 21, 35, 49 days , 5 layers of each group were sacrificed and index numbers of thymus , spleen and bursa Fabricius were calculated. Every week , HI test result s with heart blood were recorded to calculate NDV antibody titers. At the age of 49 days, phagocytic percentage and phagocytic index were observed. The result s demonstrated that Qingliang Chinese-Herb decoction could increased the spleen , thymus and bursa Fabricius weight and phagocytic percentage and phagocytic index. It could also significantly enhance NDV antibody titers. It is indicated that Qingliang Chinese-Herb decoction could improve the immunity in chicken. ［Key Word］Qingliang Chinese-Herb decoction,immunological function , chicken 清凉冲剂是以石膏为主要成分的抗热应激中药方剂，其作用机理是通过增强散热和提高机体免疫水平这两个方面来达到抗热应激的目。石膏又名白虎，是中医清热泻火治气分实热证的要药，[1]在20世纪80年代前主要是通过研究石膏有无退热作用，来对其作用机制进行探讨。在近年的研究中发现，石膏亦能够非特异性增强动物细胞及体液免疫水平。[2，3，4] 本研究将观察服用清凉冲剂后，鸡免疫器官指数、NDV抗体水平以及腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数各项指标的变化，来探讨含有石膏成分的清凉冲剂对鸡免疫功能的影响。从而为清凉冲剂的开发奠定一定的理论基础。 1. 材料与方法 1.1材料 1.1.1 药物及主要试剂 清凉冲剂，主要成分以石膏为主，藿香等中草药为辅。采用传统中药煎煮方法将中草药制成水煎液，并浓缩成1g/ml，作为实验药剂。鸡新城疫克隆C30活疫苗（SPF）、鸡新城疫低毒力活疫苗（Lasota 系）(辽宁省益康生物制品厂产品)，购自中国兽药监察所。5 %的鸡红细胞悬液，由笔者所在实验室自行制备。 1.1.2 实验动物与饲养管理 农大3号1日龄公雏，购自北京昌平区鸡场。雏鸡饲喂北京震亚饲料厂生产的蛋雏鸡全价料（ME＝12.18MJ/kg，CP＝18.45％），自由采食与饮水。光照时间1～3日龄为23小时/天，从4日龄起，每天减少2h，直至8小时/天时为止。鸡舍内温度1～3日龄为30～33℃，4～7日龄为28～30℃，以后每周降低2℃，直至18～20℃为止。 1.2实验方法 1.2.1免疫器官指数的测定和计算 在7、21、35和49日龄，实验组和对照组各随机抽取5羽试验鸡，称重后迅速处死并完整剥离每只鸡的胸腺、脾脏和法氏囊，称重。按照下述公式计算每只鸡的胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数：免疫器官指数= 免疫器官重(mg)/体重(g)。[5]用MINITAB Release 10.1软件进行平均数运算和方差计算，分析各实验组各个指标之间的差异显著性。（下同） 1.2.2NDV血清抗体水平的测定 鸡新城疫的免疫采用鸡新城疫克隆C30活疫苗（SPF），于7日龄滴鼻点眼首免，1头份/只；21，35日龄时用鸡新城疫低毒力活疫苗（Lasota 系）饮水进行二免和三免，2头份/只。分别于7、14、21、28、35、42和49日龄采血分离血清，实验组与对照组分别随机抽取10只鸡。按常规方法用96孔“V”形血凝板进行血凝抑制试验（HI），测定NDV血清抗体的血凝抑制效价，以log2表示。 1.2.3鸡腹腔内巨噬细胞吞噬功能的测定 取49日龄实验组和对照组鸡各5只。检测前1天每只鸡腹腔注射质量分数为0. 5 %的淀粉生理盐水1.0ml，检测时每只鸡腹腔注射体积分数为5 %的鸡红细胞悬液1.0 ml；30min后颈静脉放血致死鸡只。经腹膜注入生理盐水3.0ml , 轻揉腹部, 然后吸出腹腔洗液1.0 ml，平均滴于2 片载玻片上，37℃温育，PBS漂洗，除去未贴片细胞，晾干，丙酮-甲醇（1∶1）固定，姬姆萨染色，每片油镜下计数200 个巨噬细胞所吞噬的鸡红细胞数。[6,7,8]按下列公式计算吞噬百分率和吞噬指数： 2.实验结果 2.1清凉冲剂对免疫器官指数的影响 不同时期各组鸡免疫器官指数见表1。 表1清凉冲剂对鸡免疫器官指数的影响 (，n=5)单位：% 7日龄 21日龄 35日龄 49日龄 胸腺指数 实验组 6.63±0.05 7.11±0.12 7.95±0.19* 7.50±0.26* 对照组 6.63±0.05 7.50±0.11 5.72±0.13 4.62±0.06 脾脏指数 实验组 1.11±0.03 1.45±0.01 1.86±0.05 2.23±0.04 对照组 1.11±0.03 1.27±0.02 1.75±0.05 1.71±0.03 法氏囊指数 实验组 3.48±0.03 6.02±0.14 4.53±0.15 3.49±0.09 对照组 3.48±0.03 6.16±0.09 4.12±0.17 2.38±0.16 （表中* 表示差异显著，P<0.05；**表示差异极显著，P<0.01） 从表1可以看出，服用清凉冲剂之后（7日龄开始），与对照组相比较，实验组鸡各免疫器官指数均有所增高。到35日龄和49日龄的时候，实验组鸡胸腺指数显著高于对照组，P<0.05。脾脏指数和法氏囊指数差异性分析均为不显著（P>0.05），但均高于对照组，说明清凉冲剂可以促进免疫器官的发育。 2.2清凉冲剂对NDV血清抗体水平 不同时期各组鸡NDV血清抗体水平见图1。 图1实验期间鸡NDV血清抗体变化曲线图 从图1可以看出，7日龄首免后，NDV血清抗体水平逐渐提升，21日龄进行二免，抗体水平继续提升，至35 日龄有所下降，之后又回升。在整个实验期间，实验组抗体水平始终高于对照组，但在14～28日龄期间，实验组抗体水平与对照组差异不显著（P>0.05）；在35日龄，实验组抗体水平与对照组差异极显著（P<0.01）；至42日龄，实验组抗体水平高于对照组，差异显著（P<0.05）； 49日龄，又回到了差异不显著的水平（P>0.05）。 2.3清凉冲剂对鸡腹腔内巨噬细胞吞噬功能的影响 图2 清凉冲剂对巨噬细胞吞噬百分率、吞噬指数的影响 油镜下，巨噬细胞体积明显大于鸡红细胞，且胞浆呈淡粉色（图3）。从图2可以看出，实验组鸡腹腔内巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数都显著高于对照组（P<0.05），说明清凉冲剂可以提高鸡腹腔内巨噬细胞的吞噬能力。    图3巨噬细胞吞噬红细胞后的形态结构（姬姆萨染色，100×）：A图表示未吞噬红细胞的巨噬细胞，B图表示正在吞噬红细胞的巨噬细胞，C图表示已吞噬红红细胞的巨噬细胞（箭头所示）。 3小结与讨论 石膏属清热类药，主要成分是含水硫酸钙，主要功效是清热泻火，防烦止渴。在免疫方学面，发现石膏及以石膏为主的复方，可明显增加免疫器官重量，[8]增强细胞吞噬功能，增加机体细胞免疫功能。[2,3,9] 本研究已经证实以石膏为主要成分的清凉冲剂可以显著提高机体的免疫功能。 机体免疫系统是一个复杂的系统,包括特异性免疫和非特异性免疫，二者相辅相成，相互联系，共同维持机体内外环境的稳定。免疫器官和免疫细胞及其产物（如抗体）是动物机体产生免疫应答的物质基础。胸腺、法氏囊和脾脏作为禽类重要的中枢免疫免疫器官和外周免疫器官，其生长发育势必与其免疫功能密切相关。一般免疫药理学试验常以药物对免疫器官的增重作为衡量其免疫功能强弱的指标之一。[10]免疫器官指数能很好的反应机体的免疫器官的重量变化，且能将个体差异的影响降低到最低限度。[11]本实验中，实验组鸡各免疫器官指数明显高于对照组，提示清凉冲剂有促进免疫器官增重的作用，从而为机体免疫功能的增强提供物质基础。 巨噬细胞是机体重要的免疫效应细胞,是机体抵抗病原体和肿瘤的第一道防线之一,在抗感染初期,吞噬和杀灭入侵微生物，发挥非特异性免疫作用。[12]在药物对免疫功能的影响作用的研究中，巨噬细胞吞噬试验是一个重要的非特异性免疫功能的观察指标。在各种微生物和免疫学实验指导中常用体内吞噬细菌法来测定吞噬细胞的吞噬功能。本研究结果表明，实验组的鸡腹腔巨噬细胞吞噬功能增强，其吞噬百分率和吞噬指扮与对照组相比有显著的差异（P<0.05），提示清凉冲剂可以提高机体的非特异性免疫能力。 ND抗体水平作为检测特异性免疫能力的指标，在本研究中被列为研究对象之一。ND至今仍是影响养禽业经济效益的主要疫病之一。免疫程序混乱、免疫抑制以及免疫后血清保护性抗体不能快速提升，也是造成这两种疫病广为传播的原因之一。[12]本研究中，整个实验期间，实验组抗体水平始终高于对照组，且在35日龄时，实验组抗体水平与对照组差异极显著（P<0.01），提示清凉冲剂在鸡生长发育的不同阶段对其特异性免疫起着连续的加强作用,使药效作用时间更加持久。 综上所述，以石膏为主要成分的复方清凉冲剂，可以明显提高鸡免疫器官指数、NDV抗体水平以及腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数，表明了清凉冲剂可以增强机体非特异性及特异性免疫功能。