甘露聚糖酶检测方法！

gentech

甘露聚糖酶活性的检验方法

原理 甘露聚糖酶水解半乳甘露聚糖. 应用二硝基水杨酸分光光度计法测定还原 糖的释放量. 活性单位 1甘露聚糖酶单位(MNU) 是指在标准条件下, 1秒钟内从一定浓度甘露聚糖溶液中释放具有还原能力相当于1纳摩尔甘露糖所需酶的量。 适用范围 本方法适合于含有产自木霉的甘露聚糖酶的酶制剂样品的测定. 安全 DNS试剂对人体有害, 防止吸入, 与皮肤及眼接触. 试验条件 底物: 半乳甘露聚糖 PH : 5.3 温度: 50°C ± 0.5°C 时间: 5 分钟 仪器 水浴锅 50°C 水浴锅 100°C 试管混匀器 分光光度计 试剂 所有溶液均用非离子水配制. 1. 柠檬酸缓冲液(0.05M, PH 5.3) 将10.5克柠檬酸(C6H8O7×H2O, Merk244) 溶入约800毫升水中, 用 1M NaOH调整PH为5.3 (消耗量约为110ml). 在容量瓶中定容1000毫升. 2. 底物- 0.3%半乳甘露聚糖 将0.6g 槐儿豆胶(Sigma G-0753)溶解于 60°C柠檬酸缓冲液中,用厨 房混合机混匀.在磁振动加热器上加热至沸点. 在冷房内(2-8°C)搅 动冷却至室温, 并使其过液溶解. 离心(10000转/分钟, 10分钟) 除去不 溶性沉淀物, 加入柠檬酸缓冲液定容至200毫升. 在 -20°C冷冻储存, 用沸水水浴锅解冻并升温至80°C. 3. DNS 试剂 将50.0克 3,5-二硝基水杨酸溶入约4升水中. 在连续磁振动条件下, 逐渐加入80.0克 NaOH 并使其溶解. 加入1500克酒石酸钾钠(Merck, 8087). 溶液可能升温至最大45°C. 冷却至室温并加水定容至5000毫升. 如果溶液混浊, 用Whatman 1号滤纸过滤. 在室温下储存于深色瓶中. 样品 样品用柠檬酸缓冲液稀释. 合适的稀释度为在反应后的吸光度为0.10-0.40. 试验 在两只试管中各加入1.8毫升底物溶液并在50°C平衡5分钟. 向一支试管加入200微升样品稀释液并混匀. 在准确5分钟后, 向每只试管加入3.0 毫升DNS试剂并混匀.在不含样品的试管(对照)加入200微升样品溶液. 将两只试管从水浴中取出立即放入开水浴中. 准确5分钟取出用冷水冷却至室温. 在540nm测定样品(相对于对照)的吸光度. 从标准曲线读出活性并乘以稀释倍数. 标准 制备20 mM 甘露糖储存液. 溶解360毫克甘露糖(Sigma M-6020) 于带刻度的烧瓶中, 用柠檬酸缓冲液溶解并定容至100毫升. 储存液可 在-20°C储存, 解冻后混匀. 储存液用柠檬酸缓冲液稀释配制成以下稀释液.

稀释液	缓冲液 (ml)	甘露糖 mmol/ml	甘露聚糖酶活性 MNU/ml
1:1.5 1:3 1:5 1:7	8.5 7 5 3	3 6 10 14	10 20 33.3 46.7

将每种标准稀释液用同样方法做重复试验: 吸取1.8毫升底物, 在50°C培养5分钟, 加入3毫升DNS和200微升标准稀释液. 对照的制备: 加入200微升缓冲液, 不加标准稀释液. 煮沸试管准确5分钟, 冷却至室温. 在540nm 测定相对于对照的吸光度. 绘制吸光度相对于甘露聚糖酶活性(MNU/ml)的曲线. 根据每次测试, 绘制一个新的标准线. 乘以甘露糖的稀释倍数1000再除以反应时间(300秒), 即得出甘露聚糖酶活性(MNU/ml).

sherier

是行标了吗？？:hehe: