导读：2020年饲料中全面禁止添加抗生素，抗生素减停对饲料养殖业带来了持续挑战，在饲料配方和养殖过程中代替抗生素的技术和寻找有效的替代产品已成为当前行业研究的热点和焦点，到目前为止还没有完全代替抗生素作用的单一产品，研究表明，饲料酶制剂具有替代抗生素的潜在价值,在众多替代饲料养殖的抗生素技术与产品中是比较被认可的一种。饲料酶制剂研究的领航人华南农业大学冯定远教授系统阐述了酶制剂能够通过间接和直接两种方式，满足抗生素的改善营养代谢而提高动物生产性能和抗菌杀菌而保持健康状况两大需求。通过影响肠道的物理性状、营养状况、微生态平衡和组织结构的完整性等几方面实现替代作用。酶制剂的替抗功能具有条件性、辅助性和累积性的特点，通过组合酶和配合酶及益生型酶制剂的筛选和高效配制才能发挥其替抗价值，相信一定会对生产和研究有所帮助和指导。全文已在《饲料工业》2020年第12期刊出。
抗生素减停对饲料养殖业带来了持续挑战，为此，人们不断研究在饲料配方和养殖过程中代替抗生素的技术和寻找有效的替代产品，各种技术措施和替代产品不断出现，不同理论假说和应用效果众说纷纭，这些情况大部分都有一定的效果和依据。但是，到目前为止，还没有哪一种技术和产品能够简单代替抗生素的作用，而只能部分接近其效能，因为任何技术措施和产品都有其独特性。从实践角度，许多技术措施和替代产品已经在尝试或者应用，2019年《国际家禽》杂志对养禽业从业者进行了一个世界范围的调查，受访者包括养禽业主、饲料配方师、兽医师等相关人员，结果显示：“为替代和补充促生长类抗生素对家禽生产性能和健康的益处，有机酸、益生菌和酶制剂被列为最受欢迎的三种抗生素替代品，受欢迎程度分别是65%、61%和54%。有机酸、益生菌和酶制剂是最有效的饲料添加剂，其有效性分别是74%、70%和68%”。所以，在众多潜在的抗生素替代产品中，最受欢迎的抗生素替代产品和最有效的饲料添加剂都是有机酸、益生菌和酶制剂。当然，这些调查统计只能作为一种参考，不能就此排除其他产品，因为饲料配方的多样性和养殖条件的复杂性，决定了没有一套简单的技术措施和路径。无论如何，从上面的调查显示，饲料酶制剂具有替代抗生素的潜在价值。在笔者的两部专著（冯定远等，2011、2020）和试验研究报告（冯定远，2017）中，部分内容都涉及酶制剂在替代抗生素应用。
1、酶制剂替代饲用抗生素的目标
很难消化的日粮可以维持数量更多的肠道微生物，添加最有效的酶，可以最大程度地减小菌群数量。Bedford等（2004）讨论到，饲喂家禽中等营养水平的小麦基础日粮，使用以木聚糖酶为主的酶制剂，可使微生物数量降低60%。因为使用抗生素可以直接作用于目标细菌，所以与酶制剂相比，更能显著地降低菌群的数量。尽管酶制剂和抗生素都使菌群数量减少，但二者的作用方式显然有很大的差别。抗生素改善生产性能的机理很多，如降低小肠中营养物质的竞争；因为控制了病原菌而减少了局部炎症的发生；因为改善了消化率和病原菌的定植而降低了肠道的厚度和长度（Thomke等，1998a、b）。后两种作用机制导致更有效的消化，降低了维持的能量需要。而酶制剂的作用效果是使肠道的菌群数量和细菌种类的变化（Brenes等，1992、1993；Gollnisch等，1996；Hock等，1997；Simon，1998；Vahjen等，1998）。抗生素作为饲料添加剂的目的包括两个方面，一是促生长作用，提高饲料报酬，改善动物的生产性能；二是抑菌抗病作用，改善健康状况，提高动物成活率和整齐度，这两方面又有关联性。所以，针对这两个目的，无抗日粮使用的代替抗生素产品也就分为两个类型，即直接替代性产品（替代抗菌抑菌功能）和间接替代性产品（替代促生长功能）。酶制剂是其中的一类可以替代抗生素的产品，而且由于酶的种类和功能广泛，同时具有抗生素的两种功能，即促生长和抗菌功能，例如葡萄糖氧化酶、溶菌酶等可以杀菌抑菌；而外源消化酶（蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）、植酸酶、非淀粉多糖酶等可以提高动物的生产性能。这是酶制剂的多种功能的一部分，酶制剂在畜禽饲料中有七种功能，包括：①营养利用功能；②肠道健康功能；③生理调控功能；④免疫调控功能；⑤脱毒解毒功能；⑥抑菌杀菌功能；⑦抗氧化功能。其中一些功能与抗生素的作用接近或相同。酶制剂的多功能性既源于酶种类的多样性，也与酶制剂在饲料养殖中应用技术的变化搭配有关，从使用技术角度，饲料酶有七种类型产品，单一的一种单酶（或者一类酶）无法简单满足抗生素功能的替代。但可以根据目的，使用复合酶、组合酶、配合酶、组合型复合酶或者组合型配合酶，当然，没有技术性的混合酶是不能解决实际问题的。
抗生素在促进动物生长的作用方式仍然未被完全理解，围绕代替抗生素的作用，最基本的是从动物肠道微生物、微生态及其病变等肠道健康方面考虑。根据抗生素在饲料养殖中应用的目的及机理，在酶制剂中，有五个领域酶制剂具有间接或者直接替代抗生素的潜力，具体包括：①具有直接营养消化功能，促进动物生长的酶制剂，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等；②能够降低日粮黏性，减少有害微生物繁殖的酶制剂，如木聚糖酶、葡聚糖酶、纤维素酶等非淀粉多糖酶；③通过降低日粮免疫原性造成的免疫应激，减少肠道病变坏死的酶制剂，如蛋白酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶等；④能够直接杀灭细菌，抑制病原菌产生危害的酶制剂，如葡萄糖氧化酶、溶菌酶、过氧化氢酶等；⑤通过产生功能性寡糖和寡肽，控制有害微生物的酶制剂，如木聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶等。酶制剂的这些替抗功能不能简单的直接代替，它们是条件性的，而且有些可能发挥重要作用，一些是辅助性的、次要的，不能简单夸大酶制剂在这方面的作用。在这些酶制剂中，选择有针对性的酶制剂进行搭配组合，特别是在传统的复合酶配制的基础上，应用我们提出的组合酶和配合酶的理论（冯定远等，2011、2020），可以代替过去使用的饲用抗生素在日粮中应用。
2、通过提高日粮消化，代替抗生素营养代谢功能的酶制剂
欧洲专家Sheppy早在2004就指出：欧盟最先颁布了饲料中禁止使用某些抗生素作为促生长剂这个决定，迫使饲料生产企业努力寻找替代品，酶制剂成为首选的措施。事实上，其本意是酶制剂的促进营养消化和利用，代替抗生素的促生产作用。同样，Thorpe等（2004）也评论到：欧盟禁止了促生长的抗生素在动物日粮中的使用，这对动物生产性能以及健康状况的影响仍需进一步研究和探讨。禁用抗生素可能导致动物生产性能下降，外源酶制剂也许可以减轻其消极后果。也就是说酶制剂可以减少因限制使用促生长抗生素而带来的损失。
酶制剂在饲料养殖中的应用最早的初衷是酶制剂能够帮助动物提高日粮的消化利用，到目前为止，酶制剂的营养功能仍然是最重要的考虑。酶制剂改善营养消化利用的途径大体有三个方面：①直接补充消化道营养水解所需的酶，消化蛋白质、碳水化合物和脂类的酶；②间接去除饲料中抗营养因子；③间接增加动物内源消化酶分泌。第一种途径是一种酶制剂单一提高一类营养的消化利用，如蛋白酶只能提高蛋白质消化利用, 作用明确。第二、第三种途径是一种酶制剂有可能同时提高几类营养的消化利用，如木聚糖酶和植酸酶理论上可以提高所有营养的消化利用，作用综合复杂。最早在畜禽饲料中使用第一代酶制剂的想法就是源于蛋白酶、淀粉酶或脂肪酶可以直接补充体内消化道相应消化酶不足的单一和对应原理。而另外某些酶制剂间接通过去除抗营养因子，提高营养成分的消化率。例如，木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶和植酸酶，最终提供更多可利用的营养。添加植酸酶能够提高蛋白质和氨基酸的消化率，而不仅仅是植物磷的利用效率。还有某些酶制剂通过诱导动物内源消化酶分泌，提高营养的消化利用。添加淀粉酶和其他一些酶，可增加动物内源消化酶分泌，提高饲料转化率和动物生长率（沈水宝，2002）。
我们前期研究了许多外源消化酶改善动物生产性能，通过补充内源酶不足，可以增加消化以减少未消化营养在后肠道过度代谢带来对抗生素需求的增加。研究表明在肉鸡日粮中添加α-淀粉酶可以显著提高肉鸡的平均日增重，降低料肉比。淀粉酶提高畜禽的生产性能的主要原因：改善肠道形态，增加绒毛长度，降低隐窝深度；提升内源酶活力，如脂肪酶，蛋白酶等；增加营养物质转运载体的基因表达量，如SGLT1、GLUT2等（赵世元，2014）。日粮中添加外源蛋白酶可以改善畜禽的生产性能，提高营养物质的消化利用率。肉鸡日粮中添加不同菌种来源的蛋白酶能显著降低耗料增重比，同时显著提高回肠末端氨基酸的表观消化率（吴建东，2014）。在低蛋白日粮中添加蛋白酶能够显著改善断奶仔猪的生产性能，提高饲料利用率，显著提高断奶仔猪总能、粗蛋白的表观消化率（黄升科，2011）。同时蛋白酶可以不同程度改善断奶仔猪肠道完整性，提高内源消化酶的活力以及营养物质转运载体的基因表达（凌宝明，2011）。幼龄动物通常脂肪酶分泌不足，添加外源脂肪酶能够缓解脂肪酶缺乏造成的负面影响。在低能量日粮中添加脂肪酶，能够显著改善黄羽肉鸡的生产性能，达到正常能量日粮肉鸡水平（雷建平，2012）。提高屠宰率和全净膛率，改善鸡肉品质（刘昌镇，2012）。
3、通过降低日粮黏性，代替抗生素减少有害微生物繁殖的酶制剂
黏性日粮的可溶性、大分子量的非淀粉多糖一方面能干扰营养物质的消化和吸收，另一方面导致肠道微生物大量繁殖，消耗营养（Bedford等，1998）。抗生素促生长剂在日粮中的使用，肠道黏度是主要考虑因素（Choct，2004）。酶制剂促进肠道健康的功能：一是与酶制剂功能的物理作用相关，通过降低黏性；二是与生化代谢作用相关，酶制剂产生的寡糖可促进肠道正常蠕动，促进有益菌的增殖,抑制有害菌的定植。酶制剂可以调节肠道健康，最典型的具有促进肠道健康功能的酶制剂是非淀粉多糖酶(包括木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶等)。
抗生素可以显著改善饲喂高非淀粉多糖（NSP）日粮的家禽的生产性能（Mac Auliffe等，1971；Misir等，1978a、b）。无论哪一种原因，家禽小肠中过量的发酵可能不利于小肠的消化和吸收，日粮中添加非淀粉多糖酶制剂可能会缓解这种状况。或许是通过降低小肠中食糜黏度，加速了食糜的通过和营养物质的消化率（通过除去黏性胶质的抑制扩散作用），因此微生物发酵的底物和发酵时间均减少，使得其繁殖减慢。这可恢复正常和有效的小肠中淀粉和蛋白质的消化（酶解作用）（Choct，2004）。
外源性酶制剂的添加降低了小麦和黑麦基础日粮的黏度，结果是减少了小肠菌群的数量（Choct等，1996；Hock等，1997）。酶制剂的添加增加了小肠中淀粉和蛋白质的排空速度，减少了微生物发酵所需要的底物。Choct等（1996）认为酶制剂与肠道健康是动物营养学的下一个挑战，NSP酶作为抗生素替代物，在家禽业中对影响经济效益的肠道坏死病(necrotic enteritis NE)的作用明显，酶制剂对黏性日粮造成的肠道坏死病有预防作用，特别是产气荚膜梭菌（C. perfringens）等有害微生物造成的肠道炎症。
猪方面的研究也有类似的结果，非淀粉多糖分解后可能产生寡糖抑制后肠道有害细菌生长，减少肠道传染病和降低腹泻率。黏性日粮与大肠炎综合症，可溶性纤维是影响非特异大肠炎综合症的关键因素，尤其是对于采食黏性的小麦基础日粮（颗粒饲料）的生长猪，添加木聚糖酶可以改善这种情况。酶制剂的使用可降低因日粮而导致的腹泻，尤其是断奶仔猪更明显（Inborr等，1988；Florou-Paneri等，1998；Kantas等，1998）。不少研究者特别强调，这些作用以及酶与治疗或亚治疗剂量的抗生素所具有的协同作用（Florou-Paneri等，1998；Kantas等，1998；Gollnisch等，1996），为未来的生产方式（不单纯依赖抗生素的生产方式）提供了可能性（Partridge，2004）。
控制酶添加效应的许多因子与影响抗菌素添加效应的因素一样（Bedford等，2004）。抗生素的添加效应与动物的生长环境有关，普通动物比无菌动物对抗生素的添加效应更明显。饲喂家禽营养合理的小麦基础日粮，使用以木聚糖酶为主的酶制剂，可使微生物数量降低60%。抗菌素的使用因直接作用于目标细菌，而显著降低细菌数量的程度比酶制剂更迅速。这两种降低细菌数量的方式是不一样的。本课题组前期多项研究表明，小麦代替玉米的肉鸡日粮中，添加木聚糖酶可以显著提高肉鸡的生产性能，提高日增重，降低料肉比（于旭华，2004；徐昌领，2011；李秧发，2010；廖细古，2006）。β-甘露聚糖酶在玉米-豆粕型基础及低能量日粮中，对肉鸡饲料转化率均有显著提高（闫晓阳，2013）。非淀粉多糖造成的食糜黏性增加，不仅阻碍内源消化酶活力，也抑制内源消化酶的分泌。添加非淀粉多糖酶对内源消化酶的活力及分泌具有显著改善。木聚糖酶能提高小肠食糜中蛋白酶、脂肪酶及淀粉酶的活力，增加小肠黏膜中麦芽糖酶和蔗糖酶的分泌（李忠良，2011）。纤维素酶对雏鹅十二指肠内容物胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶活性具有显著提高作用（杨彬，2004）。肠道微生物过度增殖是非淀粉多糖影响畜禽健康的重要因素，而非淀粉多糖酶的添加对肠道微生物有着显著的影响。木聚糖酶能够显著增加肉鸡后肠中乳酸杆菌的丰度，减少大肠杆菌的丰度（辛锦兰，2011）。纤维素酶在肉鹅高纤维日粮中显著降低了盲肠内容物大肠杆菌的数量（黄燕华，2004）。非淀粉多糖酶对梭状芽孢杆菌等有害菌的增殖有抑制作用（Jackson等，2003）。非淀粉多糖造成的食糜黏性使得肠黏膜层变厚，肠壁厚度增加，降低了营养物质的吸收，而非淀粉多糖酶能有效地改善畜禽肠道形态，增加绒毛长度，降低隐窝深度，提高肠道紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1基因表达量，从而提高营养物质的表观消化率和能量真消化率（李忠良，2011；雷钊，2013）。
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通过直接杀灭细菌， 代替抗生素抑制病原菌危害的酶制剂
最典型的具有病原菌杀菌抑菌功能的酶制剂是葡萄糖氧化酶和溶菌酶，饲料中添加葡萄糖氧化酶是替抗、减抗的有效手段。冯定远（2016）讨论综合了葡萄糖氧化酶在日粮中替代抗生素的机理和应用价值。葡萄糖氧化酶的作用是催化葡萄糖氧化分解，造成两个结果：一是消耗环境中氧，造成厌氧环境；二是产生葡萄糖酸，维持酸性环境，这两个方面都对微生物特别是病原性细菌是不利的。而另一种酶过氧化氢酶能够将过氧化氢分解生成水和氧，而后水又与葡萄糖酸内酯结合产生葡萄糖酸。 葡萄糖氧化酶主要是通过非营养、非消化方式改善消化道的内环境和微生态，通过三个途径对病原菌杀菌、抑菌，其一通过氧化葡萄糖，生成葡萄糖酸，降低胃肠道内酸性，酸性环境有利于抑制病原菌；其二通过氧化反应消耗胃肠道内氧含量，营造厌氧环境，厌氧环境有利于抑制病原菌；其三反应产生一定量过氧化氢，过氧化氢的氧化能力是广谱杀菌，大部分肠道病原菌都是耗氧菌，大部分有益微生物都是厌氧菌或兼性厌氧菌，消耗氧气有助于增殖有益菌。对大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、葡萄球菌、弧菌等有害菌进行抑制，达到维持肠道菌群平衡，保证动物健康。作用机理有别于抗生素，不会产生抗药性或药物残留，为绿色生态养殖提供了另一条通途。 葡萄糖氧化酶替抗作用及其机理主要是由于葡萄糖氧化酶作用于病原菌的物理生存环境，能专一分解β-D-葡萄糖成为葡萄糖酸和过氧化氢，同时消耗大量的氧气。葡萄糖氧化酶作为一种新型的饲料添加剂具有部分的抗生素效果，例如提高动物生产性能，保护肠道健康和增强动物免疫力（Tang等，2016）。葡萄糖氧化酶的生理功能主要表现在两个方面：①制造厌氧环境，增加肠道酸性，消除肠道病菌生存环境，抑制病原菌的生长。葡萄糖氧化酶进入肠道，以葡萄糖作为底物，生成葡萄糖酸和过氧化氢。过氧化氢具有广谱杀菌作用，可以起到抑制大肠杆菌、沙门氏菌等致病微生物生长繁殖的作用（杨久仙等，2011）；葡萄糖氧化酶消耗氧气形成的厌氧环境，抑制有害菌的生长，促进有益菌，形成优势菌群，改善肠道菌群，保护肠道健康；生成的葡萄糖酸具有酸化剂的功效，促进胃肠道食糜产生更多的短链脂肪酸，改善肠道微生态（Tsukahara等，2002）。②保护肠道上皮细胞完整，处于应激或病理状态的动物会产生大量自由基，当自由基超过机体自身的清除能力时就会破坏肠道上皮细胞；添加葡萄糖氧化酶可以清除这些自由基，能保护肠道上皮细胞的完整性，阻止大量病原菌的入侵，提高免疫力，促进动物健康快速生长（吕进宏等，2004）。目前研究葡萄糖氧化酶对畜禽肠道微生物的影响主要通过体外抑菌试验和针对特异菌种的检测，然而探索葡萄糖氧化酶对如何改善畜禽整体的微生物区系，将会为其应用提供更加充分的理论基础。 同时，葡萄糖氧化酶还具有抗氧化作用，能有效清除自由基，保护肠道上皮细胞的完整性，使球虫侵入肠道上皮寄生部位的机会大大降低，从而达到防御球虫的目的。添加葡萄糖氧化酶仔猪的血清SOD和GSH-Px含量水平，跟无抗生素组相比，都有显著性升高（P<0.05）。和无抗生素组相比，肝脏中的GSH-Px含量水平有显著性的提高（P<0.05）。由此说明葡萄糖氧化酶可增强断奶仔猪的抗氧化能力，从而降低断奶仔猪的肠道炎症反应，维持肠道健康和稳态，减少腹泻（陈嘉铭，2019）。 在我们的研究中，玉米豆粕型肉鸡日粮中添加葡萄糖氧化酶与空白组和抗生素组相比，葡萄糖氧化酶组平均日增重分别提高5.08%和2.09%，平均日采食量分别提高1.83%和0.01%，料肉比分别降低3.11%和1.97%；葡萄糖氧化酶对肠道形态亦有改善作用，增加绒毛高度，提高肠道物理屏障相关基因表达，如ZO-1、Occludin等。此外葡萄糖氧化酶减轻了肠道免疫反应，降低相关炎症基因的表达，如IL-1β、IL-4及IL-8等。盲肠内容物16S rDNA分析发现添加葡萄糖氧化酶相比于对照组和抗生素组可以显著提高肉鸡盲肠食糜中的OTU值，表明葡萄糖氧化酶促进肠道菌群的多样性，也证实抗生素对肠道菌群整体的破坏。葡萄糖氧化酶可以降低拟杆菌门的相对丰度，提高放线菌门的相对丰度以及厚壁菌门与拟杆菌门的比值，对拟杆菌门的拟杆菌科和紫单胞菌科，厚壁菌门中的瘤胃菌科和毛螺旋菌科的相对丰度都有显著的影响。抗生素对肠道菌群的影响较为剧烈，对有益菌和有害菌的无差别的杀灭作用，长期使用抗生素能够造成肠道菌群动态的失衡。而葡萄糖氧化酶对肠道微生物的作用与抗生素相似，但相对温和，特别是对有益菌的抑制作用。因此，葡萄糖氧化酶对肠道菌群结构有一定的改善作用（黄婧溪，2018）。 过氧化氢酶是基于消减自由基维护机体氧化还原平衡、控制氧化损伤来降低对抗生素需求。正常生理活动下，体内氧自由基的产生与清除处于动态平衡状态。当畜禽周围环境骤变或者处于特殊的生理状况，会导致自由基大量产生，超过机体的清除速度，自由基就会在体内过量累积，就会出现氧化应激。而过量的自由基破坏肠道组织中DNA、脂质、蛋白质等生物大分子，造成肠道氧化应激损伤，导致动物腹泻、肠炎、菌群紊乱等，影响营养物质的消化吸收，从而损害动物的生长发育（李维等，2016）。过氧化氢酶是动物植物体内广泛存在的末端氧化酶，又称为“触酶”，是参与活性氧代谢的重要因子之一，与超氧化物歧化酶、过氧化物酶等共同组成了生物体内活性氧防御系统，在清除氧自由基方面发挥重要作用。过氧化氢酶的主要作用就是通过催化电子对的转移将H2O2转化为对机体无害的水和氧气，从而清除体内堆积的超氧阴离子和减少生成羟自由基等强活性的自由基，同时有效降低自由基对肠上皮细胞的损伤，从而维护仔猪肠道结构的完整性。 本课题组研究表明日粮添加过氧化氢酶能有效替代氧化锌在断奶仔猪中的应用。24日龄断奶仔猪基础日粮中分别添加氧化锌和过氧化氢酶，饲养14 d，结果表明，添加过氧化氢酶显著降低料肉比和腹泻率；改善肠道形态，显著提高绒毛高度，降低隐窝深度；减轻仔猪的氧化应激，提高抗氧化能力，显著降低血清中丙二醛的含量，提高血清中谷胱甘肽的含量和超氧阴离子的抑制能力。细胞实验表明过氧化氢酶能显著降低过氧化氢对肠道上皮细胞的损伤，增加细胞活力（方锐，2017）。过氧化氢酶能改善母猪的繁殖性能和抗氧化能力。母猪妊娠后期添加过氧化氢酶能一定程度提高总产仔数；血液和初乳中的总抗氧化能力和谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶的活力均有显著地提高；对仔猪的腹泻率也有显著的降低（张志东，2017）。研究证明，外源添加过氧化氢酶能有效地帮助动物清除氧自由基，提高机体的抗氧化能力，缓解氧自由基造成的损伤，改善动物生产性能，达到减抗替抗的效果。 另外一类杀菌的酶制剂是通过对细菌细胞壁水解，这些酶包括溶菌酶、β-甘露聚糖酶、壳聚糖酶和β-葡聚糖酶等。溶菌酶是一种作用于β-1，4糖苷键的细胞壁溶解酶；也有作用于肽“尾”和酰胺部分的细胞壁溶解酶。目前微生物溶菌酶分5种：①内N-乙酰己糖胺酶，此酶同于鸡蛋清溶菌酶，破坏细菌细胞壁肽聚糖中的β-1，4糖苷键；②酰胺酶，切断细菌细胞壁肽聚糖中NAM与肽“尾”之间的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸键；③内肽酶，使肽“尾”及肽“桥”内的肽键断裂；④β-1，3、β-1，6葡聚糖酶和甘露聚糖酶，此酶分解酵母细胞的细胞壁；⑤壳聚糖酶，这是分解霉菌细胞壁的一种溶菌酶。 除了溶菌酶和葡萄糖氧化酶直接杀菌抑菌外，还有一个特别的酶制剂代替抗生素抑菌例子，例如脂肪酶。某些脂肪酶它不是通过营养作用，而是直接抑制病原微生物。Dierick等（2002、2004）利用含有中链脂肪酸的油脂和脂肪酶的协同作用，在模拟胃环境 （37 ℃、pH值3~6、3 h）下的组合水解试验表明，适量添加脂肪酶能部分释放中短链脂肪酸，特别是月桂酸、丁酸一类产物。试验表明这些中链脂肪酸能够调节和稳定胃肠道微生物群系，对有害微生物的生长具有显著的抑制作用，起到类似抗生素的作用。由此推测，脂肪酸和脂肪酶的合理组合可能起到降低仔猪饲料中抗生素使用量的作用。 除了对细菌有杀灭作用外，某些特别的酶制剂也显示对病毒有抑制作用。我们正在进行的试验也显示果胶酶能够产生一些产物，具有抑菌的潜能（张源，2020）。 所以，根据作用机理，有抑菌作用的酶大体有四类：葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶等通过厌氧条件、溶菌酶和壳聚糖酶等作用细胞壁、脂肪酶产生的特别是中短链脂肪酸、果胶酶等系列产物，这需要进一步总结。
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通过降低日粮免疫原性， 代替抗生素减少肠道病变坏死的酶制剂
某些特别的非淀粉多糖能刺激动物固有免疫系统，刺激机体产生多余的免疫反应，消耗能量，影响生产性能。通过添加抗生素能够降低日粮中非淀粉多糖对畜禽造成的消极影响（Teirlynck等，2009），而针对性的非淀粉多糖酶也有类似效果。非淀粉多糖的种类很多，只有少数才具有免疫原性。其中具有复杂侧链异多糖的β-甘露聚糖，特别是β-半乳甘露聚糖具有免疫原性，它产生的免疫应激与抗原蛋白不同。由于与病原（致病菌）相关分子模式（Pathogen Associated Molecular Pattern, PAMP）相似，动物肠道上存在相应的抗原的模式识别受体（PRR），它能够与β-半乳甘露聚糖结合引起免疫应激，造成肠道溃疡等炎症，同时造成营养特别是能量的消耗。Hsiao等（2006）认为：β-半乳甘露聚糖由于与组成多种病原体（致病菌）的表面成分（Surface Components of Multiple Pathogens，SCMP）相似，能够刺激特有的免疫系统，导致无目的性的能量损耗的免疫反应。肠道上的受体（PRR）与β-半乳甘露聚糖的PAMP结合引起免疫应激，可通过测定血清中α-1-酸性糖蛋白(AGP)作为免疫反应指标。最近进行的瓜尔豆来源的β-半乳甘露聚糖也显示其对肠道免疫功能的影响（付饶，2020）。 这种免疫反应导致慢性炎症，β-甘露聚糖酶可以减少由于免疫反应造成的肉鸡坏死肠炎损害，与艾美球虫和产气荚膜梭菌（C. Perfringens）的侵袭模式相同。饲料源性免疫反应（feed induced immune response, FIIR）导致的长时间持续免疫应激，所造成的能量等营养消耗的累积是明显的，将影响动物生产性能。特异性β-甘露聚酶可消除β-半乳甘露聚糖的免疫原性。 Arsenault等（2017）通过对相关蛋白磷酸化信号的数据分析表明：在含有瓜尔豆粕日粮中添加β-甘露聚糖酶可以消除β-半乳甘露聚糖造成的饲料源性免疫反应（FIIR），降低免疫信号。β-甘露聚糖酶也可以降低免疫球蛋白IgG的产生（Li等，2010）、降低粒性白细胞（Mehri等，2010）、降低免疫器官法氏囊和脾脏的相对重量（Ferreira等，2016）。所以，特殊的非淀粉多糖（例如β-甘露聚糖）不仅能造成食糜黏性，降低动物生产性能，同时能造成动物机体产生免疫反应，导致能量流失，降低生产性能（Hsiao等，2006）。 Teirlynck等（2009）研究发现高非淀粉多糖的小麦日粮能诱导肠壁中的淋巴细胞浸润并诱导上皮细胞的凋亡，远远超过具有低水平可溶性NSP的谷物如玉米。Ferreira等（2016）添加β-甘露聚糖酶能减少脾脏和法氏囊的相对重量，同时降低血液中IgA，IgG和IgM的含量，减少免疫反应耗用营养物质，改善生产性能。Arsenault等（2017）通过激酶组学分析发现在肉鸡日粮中额外添加β-甘露聚糖能激活多个免疫相关的信号通路，而β-甘露聚糖酶能消除对应的免疫信号。表明非淀粉多糖酶能够减轻饲料源性造成肠道免疫反应，类似抗生素的作用效果。Partridge（2004）认为酶制剂是防止猪的非特异大肠炎综合症的关键因素，为未来的生产方式，特别是不单纯依赖抗生素的生产方式，提供了可能性。 除了特异性的β-半乳甘露聚糖具有免疫原性，长时间造成的免疫反应而导致动物肠道的坏死性肠炎外，大分子的蛋白，特别是豆科的大豆蛋白引起幼年哺乳动物的肠道免疫反应也是人们关注的一个课题。大豆蛋白的免疫原性引起的肠道损害与β-半乳甘露聚糖的性质是不一样的，但都会引起肠道的病变，只能通过抗生素来加以克服，断奶仔猪日粮离不开抗生素的原因也在这里。抗原蛋白的问题一般是通过膨化或者发酵处理加以克服，而蛋白酶，特别是应用多种性质不同的蛋白酶组成的组合酶，理论上是可以解决其免疫原性问题，在仔猪无抗日粮的配制中，高效、有针对性的蛋白酶也是应该考虑的一个措施，但专门关注研究的并不多。
6 通过产生功能性寡糖和寡肽， 代替抗生素控制有害微生物的酶制剂
抗生素在饲料养殖中应用的功能是综合性的，替代抗生素的技术措施也是多样性的，这也是为什么到目前为止，替抗技术与产品五花八门，良莠不齐。既有技术和产品本身的因素，也有认识和技术水平的因素。由于酶制剂种类繁多，功能复杂。酶制剂除了上面四个具有比较明确的替抗领域外，还有比较间接的应用领域，即酶制剂水解产物，部分酶解产生的功能性寡糖和寡肽具有调节肠道健康的作用，在替抗方面起到辅助的作用，作为益生元的功能性寡糖（低聚糖）尤为明显。根据肠道微生态平衡和微生物菌群调节的特点，利用酶制剂的干预机制，我们提出了益生型饲料酶制剂的理论（冯定远等，2020）。 产生寡糖等功能性酶解产物实现减抗替抗作用，低聚糖被认为以益生元的形式发挥作用。低聚糖一般经过胃和小肠而不被消化吸收，直接到达动物后肠段，被有益菌利用，生成乙酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸，不仅能为肠黏膜细胞提供能量，促进细胞的生长代谢，还可以降低结肠内pH值环境，抑制有害菌的生长。高度难消化日粮维持更大数量的肠道微生物，酶的添加使得菌群数量最大程度地减小，木聚糖酶可使微生物数量降低60%。肉仔鸡小麦日粮中添加木聚糖酶，导致利用淀粉和蛋白的细菌数量减少（Vahjen等，1998），利用木糖的微生物数量增加，酶处理组的细菌总数仅有对照组的40%。高纤维日粮中添加纤维素酶可显著减少盲肠内容物大肠杆菌数，同时显著增加了有益的乳酸杆菌数。在我们的研究中，肉鸡日粮中添加低聚木糖和乳酸杆菌配伍能提高肉鸡的饲料转化率，改善血清中IGF-1的含量；能够改善肉鸡肠道形态，提高肠道紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和F11的基因表达量，抑制有害菌的增殖，增加有益菌丰度（Yusuf，2014）。以小麦作为酶解底物，添加不同类型的木聚糖酶，进行体外酶解。采用高效液相色谱测定木聚糖水解产物的组成，结果表明酶解产物85%以上集中在木二糖及木三糖。利用酶解产物培养细菌发现，其对乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌有显著的增殖作用；此外发现，木聚糖水解产物能够显著降低大肠杆菌对肠道上皮细胞的黏附率，减少细胞LDH的释放量，降低大肠杆菌对细胞的损伤作用（雷钊，2013）。马岩（2015）研究发现木二糖和木三糖均能促进乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌的增殖，并且减少大肠杆菌和沙门氏菌对鸡肠道上皮细胞的黏附，缓解对细胞造成的损伤。雏鸡盲肠微生物检测得到相似的结果。为了进一步了解低聚木糖对细菌的影响，本课题组通过分别添加5 mg/ml的木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖及木六糖于鼠伤寒沙门氏菌培养基中连续体外培养36 h，分点测定吸光值，发现木糖、木五糖及木六糖均能显著抑制沙门氏菌的增殖；经5 mg/ml的木糖及低聚木糖培养4 h后的鼠伤寒沙门氏菌均显著降低对IPEC-J2的黏附率，其中以木糖效果最好，黏附率降低49.3%，其余组分降低的比例分别为27.13%、37.04%、17.48%、21.91%、41.20%。通过测定细胞培养基中LDH的含量发现，木糖及低聚木糖均能不同程度缓解鼠伤寒沙门氏菌对细胞的损伤。经转录组学分析，木糖及低聚木糖影响沙门氏菌活动的各个方面，而可能通过改变其生长、黏附相关基因galk、speA、smpB的表达来实现颉颃作用（欧阳海燕，2017）。低聚糖可能通过直接黏附在细菌表面，以及通过影响黏附相关基因的表达，改变肠道中存在的有害菌的黏附潜力（Ebersbach等，2012）。揭示了低聚糖在抑菌方面代替促生长抗生素的潜力，所以，木聚糖酶的添加，可以产生功能性寡糖，起到协同替代抗生素的作用，当然，这种功能可能是潜在的、辅助的和累积的，未必能够达到显著的性能改善水平。 总而言之，酶制剂代替抗生素在饲料养殖中的应用包括五类酶具有间接或者直接替代抗生素的潜力，具有直接营养消化功能，促进动物生长的酶制剂；能够降低日粮黏性，减少有害微生物繁殖的酶制剂；通过降低日粮免疫原性，减少肠道病变坏死的酶制剂；能够直接杀灭细菌，抑制病原菌产生危害的酶制剂；通过产生功能性寡糖和寡肽，控制有害微生物的酶制剂。它们的作用机理是通过影响肠道的物理性状、生化条件、微生态平衡和组织结构的完整性等几方面实现。酶制剂的替抗功能具有条件性、辅助性和累积性的特点，只有在复合酶的基础上，应用组合酶和配合酶及益生型酶制剂的理论才能配制高效的饲料酶制剂添加剂，达到代替过去使用的饲用抗生素在日粮中应用的目的。
参考文献及更多内容详见：饲料工业，2020，41（12）：1-10
作者简介
冯定远，华南农业大学教授、博士生导师。农业农村部饲料评审委员会委员、全国饲料标准化委员会委员。中国动物营养学会常务理事、饲料安全与饲料生物技术专业委员会主任。中国饲料工业协会常务理事、广东省饲料行业协会名誉会长。华南农业大学毕业后留校任教，从事动物营养与饲料科学的科研与教学工作，重点研究领域在饲料生物技术和饲料营养价值评定。
来源：饲料工业
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发表于 2020-6-30 10:52:50
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