枯草芽孢杆菌发酵探讨

29625248 · 发表于 2019-4-29 11:19:08

枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一，已被越来越多地研制成饲用微生态制剂。因其制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色”添加剂，故具有广阔的发展前景，并已在畜牧业、饲料业广泛应用，显示巨大的社会效益和生态效益。枯草芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能产生抗菌素，在动物肠道内具有较强生物夺氧能力。这些特性对促进动物营养的消化吸收、提高动物的饲料转化率、防病和促进生长起到重要作用。鉴于此，国内外专家学者对研究开发枯草芽孢杆菌制剂用于畜禽养殖日趋关注，从而也促进了这一产业的迅猛发展，但在现阶段的工业化生产中，存在着制约枯草芽孢杆菌发酵的诸多因素。

1、枯草芽孢杆菌的生物学特点

杆菌：一般（0.7～0.8）×（2.0～3.0）μm，电子显微镜测量为（0.5～0.6）×（1.1～3.5）μm，革兰氏阳性，运动，有长而又丰富的周生鞭毛。

芽孢：椭圆形，中生或偏中生，即使孢囊膨大也不显著。

生长温度：最高温度45～55℃；最低温度5～20℃。

阳性反应：接触酶；V-P反应；在7％的氯化钠中生长；pH5.7生长；分解葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸；水解淀粉；利用柠檬酸作为碳源；还原硝酸盐为亚硝酸盐；分解酪素；石蕊牛奶产碱胨化。

阴性反应：厌氧生长；卵黄反应：在葡萄糖洋菜上或酪氨酸洋菜上形成可溶性黑色素；28℃4星期水解马尿酸盐；利用丙酸盐并分解酪氨酸。在55℃生长的菌株被0.02％的叠氮化合物抑制。

变化的性质：在V-P液中产酸(pH5.0～8.0)；对溶菌酶的抗性；在10％的氯化钠中生长。

2、芽孢杆菌制剂的作用机理

2.1可产生酶类和营养物质

研究表明芽孢杆菌能够分泌大量的胞外酶，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等，有助动物对饲料的降解、消化，提高饲料利用率。饲料中未被消化的蛋白质和一些含氮物质在肠道中被大肠杆菌和其他细菌脱梭生成具有潜在的毒性的腐胺、吲哚、酚类等物质。一些芽孢杆菌可产生氨基氧化、SOD酶、分解硫化氢的酶以及其他抗菌物质如过氧化氢，起到杀菌作用，从而减少动物体内有害物质的产生。研究表明一些芽孢杆菌产生SOD酶，SOD可以清除生物体内活性氧自由基，减少其对细胞的毒害作用，使生物体免受伤害。芽孢杆菌在生长繁殖过程中可以产生挥发性脂肪酸，如乙酸、丙酸、丁酸等，一些脂肪酸可降低动物肠道的pH，从而为乳酸菌的生长创造条件，并且抑制病菌的生长。其中丙酸还可以参与三梭酸循环，为动物的新陈代谢提供能量。同时，能够产生很高的维生素B和维生素C，为动物提供维生素营养。1996年Ozols对106株肠道菌进行研究发现芽孢杆菌是维生素Bl和维生素B6的主要生产者；1998年倪学勤等研究表明芽孢杆菌产生有机酸为机体提供能量营养的同时，还促进动物对钙、磷、铁的吸收利用。

2.2生物夺氧与生物拮抗作用

肠道原籍菌群是肠道的优势菌，大多厌氧，而致病菌多为需氧菌。人为引入的益生芽孢杆菌在肠道定植后，消耗大量的游离氧，造成厌氧环境，可减少需氧菌对肠道的定植，并有利于乳酸杆菌和双歧杆菌等厌氧菌的生长，致使体内的有益菌增加而致病菌减少，保持肠道微生态系统平衡。芽孢杆菌与有害菌竞争基本营养物质和肠道等黏膜结合位点，抑制有害菌从而减少肠道疾病，提高机体抗病能力。

2.3提高机体的免疫能力

近年来研究表明，芽孢杆菌能分泌活性抗菌物质，使肠道相关淋巴组织处于高度反应状态。同时T、B淋巴细胞的数量增多，动物体液和细胞免疫水平提高。1992年Jonsson等报道，芽孢杆菌分泌胞外酶系的同时还产生抗生素。

3、芽孢杆菌饲料添加剂的应用优势

乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌作为益生菌的3种主要菌种来源，各自具有不同的生物学特性，在生产上也是各有不同。相对于另外两种微生物，尤其是应用最为广泛的乳酸杆菌，芽孢杆菌具有独特的优势，主要体现在以下三个方面。

3.1安全性很多种类芽孢杆菌及其代谢产物已广泛应用于食品、饲料中，目前尚未发现毒副作用，是一种安全的菌种。许多芽孢杆菌及其代谢物很早就被人们有意无意地在食品、医药和饲料中使用，一些芽孢杆菌属于“公认安全(GRAs)”的菌种，芽孢杆菌代谢产生的多种酶，如纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶已在食品与饲料中广泛应用。芽孢杆菌作为益生菌对动物无毒害，生产出的肉蛋类食品也是安全的。

3.2代谢速度快芽孢杆菌易于分离、培养与保存，一般对营养要求比较简单，代谢速度比较快，对于工业生产的要求不高。另外芽孢对热、紫外线、电离辐射和某些化学药品有很强的抗性，可忍受不良环境，比如可以在pH酸性环境生存，也可以在温度高达80℃甚至更高的环境中生长。

3.3分子加工操作简便目前芽孢杆菌的分子生物学研究已比较深入，可以利用分子生物学工具和知识研发高产性能的菌种，提高微生态制剂的饲喂效果，比如可以把蛋白酶、木聚糖酶的基因转移到芽孢杆菌中进行表达等，更大程度地发挥芽孢杆菌的益生作用。

4、枯草芽孢杆菌发酵研究

所谓发酵，是借助微生物大量生成积累特定的代谢产物的现象。发酵工程是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。发酵工程的内容包括菌种的选育、培养基的配制。灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面。

早在1975年，美国用苏云金杆菌(Bacillus thuringiensisBerliner)发酵制各种杀虫剂，以后各种芽孢杆菌被应用进行发酵生产各种产物。如应用地衣芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶；利用耐碱性芽孢杆菌制备碱性淀粉酶；以枯草芽孢杆菌为出发菌株发酵生产中性蛋白酶、木聚糖酶、D-核糖、A-乙酰乳酸脱羧酶、B2甘露聚糖酶、肌苷、碱性果胶裂解酶。枯草芽孢杆菌可以以内生芽孢的形式发挥其功能。当前，研究人员已经开始对以芽孢作为发酵产物的发酵体系进行摸索和优化。张根伟等对发酵培养基的组分和其他发酵条件进行研究构建了枯草芽孢杆菌BS-6的液体发酵体系，使该菌的最后发酵水平为1.66×109CFU/mL。考虑到发酵培养基原料成本及获得途径便利等因素，麸皮、玉米粉、豆米粉等材料已经用于该类细菌的发酵生产，并获得较高的芽孢产量。

4.1影响芽孢杆菌发酵的因素芽孢杆菌产生的对热、紫外线、电磁辐射和某些化学药品有强抗性的芽孢，可忍受各种不良环境，能防治多种植物病害，易定殖在植物表面。其芽孢可以制成粉剂、可湿性粉剂等各种剂型的生防制剂而应用于农业生产，此制剂具有与化学农药混用而不失活的特性。因此，有必要对芽孢杆菌的产孢特性进行研究，以期获得最佳产孢条件，最终获得商品化芽孢制剂。微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能，而且要提供合适的发酵条件，才能使它的生产能力充分发挥出来。优化发酵工艺可以充分发挥菌种的潜在能力，提高发酵过程的生产效率，降低生产成本。因此，工艺优化的研究尤其重要。

发酵工艺的研究可从以下两方面入手：(1)培养基组分的影响：包括碳源、氮源、维生素和辅酶、无机盐及微量元素等。

(2)发酵条件的影响：包括温度、初始pH、初始接种量、装液量、转速等。

4.1.1 培养基对发酵的影响

培养基是人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。培养基的组成对菌体生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离精制乃至产品的质量和产量都有重要影响。发酵工艺可分为斜面种子培养、种子扩大培养、发酵罐内菌体培养、和产物合成等几个培养过程。种子培养基是供菌体生长繁殖用的，营养成分应是易被菌体吸收利用，比较丰富和完整，其中氮源和维生素的含量应略高些，但总浓度略低为宜，以便菌体的生长繁殖。发酵培养基是供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用的。发酵培养基的组成要考虑菌体在发酵过程中的各种生化代谢的协调，在产物合成期，使发酵液的pH不出现大的波动。采用的原材料质量相对稳定，同时不影响产品的分离精制，不影响产品的质量。每个过程都有其培养基组成和制备工艺条件的要求。因此必须按照不同培养阶段的微生物生理学特性提供适宜的培养基配方。

4.1.1.1 碳源对发酵的影响

碳源是组成培养基的主要成分之一，其主要作用是供给菌种生命活动所需要的能量和构成菌体细胞成分和代谢产物中的碳素来源。一般的微生物可以在含各种碳水化合物的培养基上良好生长，但它们产物的生产能力和碳源的种类有很大关系。碳源的种类及浓度，主要是由菌种耐渗透压高低和调节细胞膜渗透性的方法来决定，所以枯草芽孢杆菌发酵采用的碳源主要有葡萄糖、糖蜜、淀粉、玉米粉等。目前，国内外主要选用玉米粉。

4.1.1.2 氮源对发酵的影晌

氮源的主要作用是微生物细胞物质和含氮代谢物的氮素来源的营养物质。氮源作为枯草芽孢杆菌发酵培养基的另一个主要因素，在芽孢的形成上也发挥着重要作用。枯草芽孢杆菌在生产中常用豆饼粉、鱼粉以及(NH4)2S04等一些试剂作氮源。C/N直接影响菌体的生长和代谢，碳源转化为微生物自身的细胞物质和代谢产物，并且是能源物质。氮源是构成微生物细胞蛋白质和核酸的主要元素，而蛋白质和核酸是微生物原生质的主要组成部分。如果C/N偏小，会导致菌体生长过剩，易造成菌体提前衰老自溶；C/N过大，菌体繁殖数量少，发酵密度低，细菌代谢不平衡，不利于产物的积累；C/N合适，但C、N源浓度过低，则会影响菌体的繁殖，C、N浓度过高，则发酵起始导致菌体大量繁殖，代谢废物过多而增加发酵液的黏度，使溶解氧降低，引起菌体代谢异常，最终也影响产物的合成。

4.1.1.3 无机盐对发酵的影响

工业发酵中应用微生物的生长繁殖和产物合成中都需要无机盐和微量元素，如磷、硫、铁、锰、钙、镁等。许多金属离子对微生物生理活性的作用与其浓度相关，低浓度往往呈现刺激作用，高浓度却表现出抑制作用。锰是枯草芽孢杆菌生长的必需元素，当培养基中缺少Mn2+时，不适合枯草芽孢杆菌的生长，促进芽孢的生成。提高Mn2+浓度将会导致培养基成分比例失调，渗透压升高等一系列变化，从而诱导芽孢生成。

磷在菌体生长、繁殖和代谢活动中起着极其重要的作用。一方面，磷是构成核酸、磷脂、许多辅酶或辅基(辅酶Ⅰ、辅酶Ⅱ、辅酶A、NAD和NADP等)以及高能磷酸化合物的重要原料，另一方面，磷在代谢调节方面也起着重要的作用，磷能促进糖代谢的进行，促进微生物的生长。因此，磷源是枯草芽孢杆菌发酵培养基中另一个重要的组成成分，它的浓度直接影响着枯草芽孢杆菌菌体的生长和芽孢的形成。

钾虽不参与细胞结构成分，但它是许多酶作用的激活剂，钾还对细胞原生质的胶体状态和细胞膜的透性起调控作用。

钙主要参与调节细胞的生理状态，如：维持细胞的胶体状态，降低细胞膜的通透性，调节pH等。

4.1.2 其他发酵参数对发酵的影响

4.1.2.1初始pH对发酵的影响

pH是微生物生长和产物合成的非常重要的状态参数，是代谢活动的综合指标。为了达到微生物的充分繁殖，培养基必须保持适当的pH。初始pH的变化对于枯草芽孢杆菌的生产发酵过程影响是非常显著的。因此，决定最佳初始pH对于细菌发酵液含菌量就显得尤为重要。

pH影响菌量的原因：1）pH会影响微生物的细胞原生质膜的电荷，使细胞原生质膜发生变化，引起原生质膜对个别离子渗透性的改变，从而影响到微生物对培养基中的一些营养物质的吸收利用以及代谢物的渗漏，进而影响微生物的生长和新陈代谢的正常进行。2）pH会直接影响到微生物细胞内的酶活性，在合适的pH下，微生物细胞内的酶才能发挥最大的活性；在不合适的pH下，微生物细胞内的某些酶的活性受到抑制，从而影响微生物的生长繁殖和新陈代谢。3）pH会影响到培养基中某些重要的营养物质和中间代谢产物的离解，从而影响微生物对这些物质的吸收和利用。

4.1.2.2温度对发酵的影响在发酵过程中需要维持生产菌的生长和生产的适当发酵条件，其中之一就是温度。温度对微生物生长的影响，是综合影响各种代谢反应的结果。温度通过影响微生物膜的液晶结构、酶和蛋白质的合成与活性，以及RNA的结构和转录，从而进一步的影响微生物的生理活动。高温会使微生物细胞内的蛋白质发生变性或凝固，同时还破坏了微生物细胞内的酶活性，从而杀死微生物；而低温又能抑制微生物的生长。任何微生物的生长都有一个最适生长温度范围，在此温度范围内，微生物生长繁殖最快。温度过高过低，芽孢杆菌生长代谢缓慢，营养体都难以形成，芽孢则更难以在营养体内产生。

4.1.2.3溶氧对发酵的影响

溶氧(Dissolve Oxygen，DO)是需氧微生物生长所必需的。枯草芽孢杆菌是好氧细菌，它产孢需要有氧气的存在。MohamedIsmail等研究过的球形芽孢杆菌(Bacillusphaerlcus)芽孢形成与溶解氧的关系一样，发现随着溶解氧的浓度升高，芽孢形成量越高。但溶解氧浓度过高，反而使产孢量下降，这是因为对于好氧枯草芽孢杆菌来说，在其他发酵条件一定的情况下，特别是在对数生长期和芽孢形成期，保证足够的通气量有利于芽孢的产生，培养基中的溶解氧水平越高越有利于芽孢的产生。但通气量过大，溶解氧过量时，由于菌体自溶反而使芽孢数下降。这与Youset的观点相同。研究发现，芽孢大量出现的时间均在枯草芽孢杆菌的对数生长末期和衰亡期以后的一段时间，但时间过长，芽孢数便会稳定在一个水平之上，符合芽孢形成规律。

4.1.2.4初始接种量对发酵的影响

接种量是指待接种的液体培养基与接入的培养液的体积百分比。由于各级种子培养时间较短，因此采用大接种量有利于菌体形成群体优势而缩短延迟期。接种量过小则可能使延迟期延长，不利于缩短发酵周期，但接种量过大也没有必要，因为过大的接种量不但不能缩短延迟期，反而会带进较多的代谢废物而不利于培养物的生长。不同的微生物由于其生理特性的不同，要求的最适接种量大小也不同。就某种特定的微生物而言，接种量的大小既取决于其自身生理特性，同时也与培养物中微生物所处的生长时期相关。

4.1.2.5装液量对发酵的影响

装液量的多少直接影响到菌体在生长过程中对氧的获得能力；同样摇床转速下，装液量少，菌体获得氧的含量高；装液量多，则菌体获得氧的含量低。氧是好氧性微生物不可缺少的营养物质之一，它参与某些物质代谢中的加氧反应。另外，氧是物质有氧降解最终的电子受体，在这个过程中，产生出微生物进行生命活动所需要的能量。对好氧性微生物来说，必须生长在有氧的环境中，供氧量的多少会直接影响到其生长或代谢作用。

总之，枯草芽孢杆菌的发酵过程中，上述的每一个因素都至关重要。其中，培养基除具备微生物必要的营养要素外，还应具有合适的比例，所以应对发酵培养基进行优化。培养基优化方法多是在单因素水平试验的基础上进行正交实验设计或是在正交试验基础上应用均匀设计理论，或者采用通用旋转组合设计，均能对培养基优化取得较好的效果。在工业化生产中，还需要对接种量、pH、温度、转速、通风比、溶氧、以及消泡剂用量等一系列因素进行严格控制，才能保证枯草芽孢杆菌发酵活菌数达到最高、发酵效果最好、在动物饲料里的添加效果最理想。

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