养殖前沿 | 酒石酸泰万菌素抑制高致病性PRRSV在体外的复制

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养猪职业经理人，微信ID：YZZYJLR2016  

导读

　　猪繁殖与呼吸综合征（PPR）是猪的一种传染性疾病，可造成母猪的生殖障碍及年幼猪的呼吸紊乱，该病是一种全球范围内具有重要经济意义的猪病。这种疾病以造成各阶段猪41℃以上高温、厌食、耳部（蓝耳）和身体变红及高死亡率为主要特征。现有疫苗仅能提供针对HP-PRRSV毒株的部分保护力。近年来有报道称大环内酯类抗生素具有抗PRRSV的抗病毒效果，因此疫苗及药物的联合使用可能会更有效地预防PRRS。

　　本研究对大环内酯类抗生素--酒石酸泰万菌素（乙酰异戊酰泰乐菌素）抑制HP-PRRSV体外复制及诱导生产的细胞线粒体超氧化物的抗病毒活力进行了测定。

1.材料和方法

　　将各种浓度（0.1、1、10及100 μg/ml）的酒石酸乙酰异戊酰泰乐菌素（API of Aivlosin®, Ecopharma Inc.）加入至MARC145细胞，于37℃作用4小时后，用PBS洗涤5次。

　　在间接免疫荧光试验（IFA）中，将HP-PRRSV 越南分离株100186-614接种至细胞后培养24至48小时，病毒的接种浓度为102及103 TCID50/ml。使用80%的丙酮固定细胞，使用感染100186-614的猪血清及FITC标记的抗猪IgG进行IFA检测，使用荧光显微镜进行荧光观察。

　　在流式细胞检测（FCM）中，使用酒石酸乙酰异戊酰泰乐菌素处理细胞，接种5x10~5 TCID50/ml 100186-614分离毒株后培养48小时。使用4%的多聚甲醛固定细胞后，0.5%皂苷进行细胞的透化，采用IFA类似方法法进行细胞染色。

　　通过EPICS XL ADC及XPO32软件对10000个细胞中的阳性细胞计数，从而计算得出总的HP-PRRSV抗原阳性细胞数。检测细胞中线粒体超氧化物时，使用100 μg/ml的酒石酸乙酰异戊酰泰乐菌素处理细胞后，加入5 μM 的MitoSOX (Molecular Probes, Invitrogen,Eugene, OR, USA)，37℃作用30分钟，用含钙、镁离子的Hank’s溶液洗涤2次，4%多聚甲醛固定细胞。

　　使用488nm FCM激光激活MitSOX，测定并收集FCM 575nm（FL2）数据，以检测细胞中的细胞中线粒体超氧化物。数据以MitoSOX荧光平均亮度直方图的方式呈现。

2.结果

　　结果表明：细胞经浓度为100μg/ml的酒石酸乙酰异戊酰泰乐菌素处理后，在IFA检测时表达HP-PRRSV抗原的细胞数量减少。然而，使用其余浓度进行细胞处理时，呈病毒阳性的细胞数并未减少，其结果与对照相同。

　　在FCM检测中，当使用100 μg/ml浓度处理细胞时，HP-PRRSV的复制减少将近20%（表1）。经其他浓度酒石酸乙酰异戊酰泰乐菌素病毒处理后的阳性细胞比例与对照组差异不显著。在检测细胞中线粒体超氧化物时，FCM直方图表明，100μg/ml酒石酸乙酰异戊酰泰乐菌素处理4小时后，MitoSOX荧光强度减少2.1± 0.3倍。

表1 FCM检测时HP-PRRSV阳性细胞比例

	酒石酸乙酰异戊酰泰乐菌素
	未处理	100 μg/ml	10 μg/ml
第一次检测	51.64%	39.86%	43.62%
第二次检测	38.82%	28.08%	43.02%

3.结论与讨论

　　本研究中，经酒石酸乙酰异戊酰泰乐菌素处理后表达HP-PRRSV抗原的细胞数量减少。结果证实，酒石酸乙酰异戊酰泰乐菌素具有抑制HP-PRRSV体外复制的抗病毒活性。这种抗病毒活性与细胞中线粒体超氧化物的增加有关。还需对酒石酸乙酰异戊酰泰乐菌素的抗病毒机制进行阐明并对其在体内的效果进行进一步鉴定。

（资料来源于世界猪病大会论文集，邱文英  译）