微生物发酵饲料生产关键因素的优化及发酵过程成分变化分析

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　　微生物发酵饲料是一种利用乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌等有益微生物对一种或多种饲料原料进行厌氧或好氧发酵，提高饲料原料营养物质的利用率，消除抗营养因子，同时有益微生物大量繁殖、富集，功能性初级、次级代谢产物大量生成的一种新型发酵生物饲料。近年来，随着生物技术的迅猛发展、肠道微生态研究的不断深入和认可，发酵饲料在畜牧业中的应用越来越广泛，其产量、质量均得到了显著的增长和提高。但相对于其他的如氨基酸、抗生素等发酵产品，发酵饲料的附加值还较低，从业人员多数无发酵专业背景，如何进一步降低生产成本，满足动物不同生长阶段产品细分和特异性营养需求是今后发酵饲料的重要发展方向。

　　目前，国内外对发酵饲料的研究主要集中在发酵菌株类型、生理功能、饲喂效果上，但对其发酵基质选择的科学性、发酵众多代谢物质的活性成分分析缺乏研究，成为了阻碍微生物发酵饲料进一步发展的壁垒。因此，笔者将着重研究水分、温度、能量和蛋白等关键因素对发酵饲料生产的影响，对其进行优化选择，并对发酵过程中各营养成分的变化进行测定分析，以期能降低发酵饲料的生产成本，为其产品的细分、不同发酵阶段的营养组成提供理论依据，最终将发酵饲料的生产技术推向生产实际。

　　01　材料与方法

　　1.1 材料

　　发酵菌株：复合发酵制剂，内含乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌，以乳酸菌为主，总菌数108个/g，由北京某公司提供。
　　培养基：MRS培养基（乳酸菌）、YPD培养基（酵母菌）、LB培养基（枯草芽孢杆菌培养基）。
　　发酵设备及方式：带有单向排气呼吸阀的PE膜密封包装，生料发酵，装袋量2kg；包装后堆积发酵，一堆6~8袋，夏天用大功率排气扇通风降温，冬天用炉火或布帘遮盖保温。
　　试验在福建省预防兽医学与兽医生物技术重点实验室，于2015年2-7月进行。

　　1.2 方法

　　1.2.1 发酵物料组成对发酵效果的影响

　　配方1（常规饲料）组成（干物质含量）：米糠13.0%、木薯粉9%、玉米粉37.5%、麸皮15.0%、棉粕23.0%、复合多维1.0%、红糖1.5%。
　　配方2（高糖分饲料）组成（干物质含量）：米糠13.0%、玉米粉42.5%、麸皮15.0%、棉粕12.5%、复合多维1.0%、玉米浆16%。
　　配方3（高蛋白饲料）组成（干物质含量）：豆粕52.0%、玉米蛋白粉20.0%、麸皮13.0%、花生粕4.0%、玉米胚芽粕7.0%、复合多维1.0%、赖氨酸1.0%、红糖2.0%。
　　各配方中设定比例的红糖用37℃温水搅拌溶解，加入总物料0.1%的菌株混匀，再与其他原料组成混合，含水量最终控制在35%~36%、装入发酵袋中进行密封发酵（生料密封发酵），发酵温度30℃，发酵12h后每隔12h取样测定其乳酸菌含量和pH变化，分析不同发酵物料组成对发酵效果的影响。
　　发酵过程中菌种含量、营养成分变化复杂，由于发酵过程是各菌共同作用结果，其中又主要以乳酸菌为主，因此最终选定以总菌含量和pH变化为指标考察发酵效果。

　　1.2.2 发酵物料含水量、温度对发酵效果的影响

　　在配方1（常规饲料）条件下，设定控制发酵物料含水量为24%~40%，30℃生料密封发酵7天，从第3天开始取样测定其总菌含量和pH，分析不同含水量对发酵效果的影响。
　　在配方1（常规饲料）、选定的最优发酵物料含水量条件下，在夏天、春天、冬天库房环境温度下进行生料密封发酵，对应发酵温度和取样时间分别为：夏天25~35℃，发酵7天，每天取样1次；春天15~25℃，发酵14天，每2天取样1次；冬天5~15℃，发酵21天，每3天取样1次。同样测定各取样样品的总菌含量和pH，分析不同环境温度对发酵效果的影响。

　　1.2.3 发酵过程菌株生长、营养成分变化分析

　　在配方1（常规饲料）、选定的最优发酵物料含水量，夏天25~35℃库房环境温度下，发酵8天，定时取样，测定各取样时间的乳酸菌、酵母菌等微生物含量和主要生成物乳酸的含量，并对发酵过程中pH、水分、纤维、能量、蛋白、氨基酸、维生素、异硫氰酸酯等指标的变化进行分析，试验重复3次，取平均值。样品取样除乳酸菌、蛋白浓度、维生素含量等需原样外，其余样品均是原样70~75℃干燥粉碎后过100目筛待用。

　　1.2.4 各指标测定分析方法

　　各微生物及总菌数含量：平板菌落计法；pH：梅特勒FE.20pH计测定；水分：105℃烘箱干燥，GB/T6435-2006；能量：KT-R4300全自动量热仪测定，ISO9831：1988；纤维：ANKOM220纤维分析仪测定，GB/T6434-2006；粗蛋白测定：Tecator1035全自动定氮仪测定，GB/T6432-1994；异硫氰酸酯：气相色谱法，GB/T13087-91；维生素、氨基酸测定采用岛津LC-20AHPLC检测；乳酸：乳酸脱氢酶法，试剂盒购买于南京某公司。

　　02　结果与分析

　　2.1 发酵物料组成对发酵效果的影响结果

　　不同发酵物料组成对发酵效果的影响结果见图1所示，在3个不同配方中，菌株生长曲线和pH变化基本一致。发酵开始时，菌株大量生长，主要发酵菌株乳酸菌分泌乳酸，pH下降；发酵120~132h左右以后，发酵趋于成熟，大量的乳酸产生抑制了菌株的生长，发酵菌株部分死亡、裂解，数量有所下降。高糖分的配方2其菌株的生长速度要明显高于其余2组，其玉米浆所含的高糖分给菌株的生长提供了大量的能量。高蛋白的配方3其菌株的生长速度明显小于其余2组，表明随着蛋白含量的增加，微生物生长速率下降。但实际畜禽饲养中，畜禽的生长不仅需要足够量的活菌，同时一定浓度的蛋白也是必须的，综合考虑，配方1中蛋白含量和糖分含量适中，更有益于发酵菌株生长和满足畜禽生长的蛋白需求。

　　2.2 发酵物料含水量、温度对发酵效果的影响结果

　　不同发酵物料含水量、温度对发酵效果的影响结果见图2~5所示，结果表明：物料的含水量越高，菌株生长越快，发酵效果越好，但在实践操作中，水分含量越高，其包装、运输、保持等操作成本越高，市场的接受度也越小。图2结果显示当含水量在32%~40%时，其总菌数含量差别不大，因此，综合考虑选定34%~36%为最适含水量，既能保证菌株快速生长，又能适当的降低生产操作成本。

　　图3~5结果显示，温度对发酵菌株的生长有着重要的影响，温度越高，菌株生长越快，其发酵成熟所需时间越段。在最优发酵条件下，夏天发酵5天，春天发酵12天，冬天发酵18天，发酵菌株的总菌数达到平衡为2.20×109个/g，物料pH4.0~4.1。

　　2.3 发酵过程菌株生长及乳酸生成的变化分析

　　发酵8天，其菌株生长及乳酸生成的变化如图6~7所示，发酵菌株由乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌组成，但各菌株的生长时间、速度不同。在密闭袋装发酵过程中，发酵前36h，发酵袋中所含残留氧供酵母菌和枯草芽孢杆菌生长，大量繁殖，乳酸菌基本不生长，乳酸生成量很少。发酵96h，发酵袋内氧气逐渐耗尽，酵母菌和枯草芽孢杆菌基本不再生长，数量达到顶峰，分别为5.14×107、4.05×108个/g。厌氧环境条件下，乳酸菌开始大量生长，开始大量产生乳酸。发酵144h，发酵趋于成熟，乳酸菌生长达到顶峰1.86×109个/g，乳酸含量最高达到0.89%。随后随着乳酸的大量产生，乳酸菌、芽孢杆菌不再适合生长，部分菌株开始裂解，总菌数下降。图6中总菌数的变化曲线与乳酸菌的变化曲线一致，表明发酵过程主要以乳酸菌为主，酵母菌和枯草芽孢杆菌的生长为乳酸菌提供了厌氧环境。

　　2.4发酵过程营养变化分析

　　发酵过程中能量、水分、异硫氰酸酯的变化分析如图8~9所示，随着发酵时间的延长，物料的总能、纤维、异硫氰酸酯含量缓慢减少，水分和蛋白含量略有增加。原因可能是酵母菌进行厌氧发酵，产生CO2和乙醇，CO2能从气孔溢出，物料总重量降低，水分、蛋白含量相对增加，物料总能相对下降；纤维、异硫氰酸酯含量降低可能是发酵菌株中产生相应的酶降解所致。发酵饲料中水分、蛋白含量增加，乙醇的生成，纤维、异硫氰酸酯含量的降低对于减少畜禽饲喂致害、提高适口性具有一定的益处。

　　发酵过程中维生素的变化分析如图10示，发酵饲料中各维生素含量的高低顺序为：VB>VE>VK>VA>VD，不同的发酵时间，各维生素含量基本保持稳定，到达降解和合成的相对平衡。

　　发酵过程中，各氨基酸含量也基本不变，仅4种氨基酸发生了较明显的变化，如图11所示，谷氨酸、脯氨酸的含量缓慢下降，甘氨酸、苯丙氨酸的含量缓慢增加，表明畜禽生长必需氨基酸含量增加，发酵饲料中氨基酸组成在向优质化方向转化。

　　03　结论

　　本研究对发酵饲料生产中的关键因素水分、温度、能量和蛋白等进行了优化研究，并对发酵过程中各营养成分的变化进行测定分析，结果表明：高糖分、低蛋白的饲料配方、34%~36%含水量、较高的发酵温度更有利于菌株生产和实际生产需求。酵母菌和枯草芽孢杆菌发酵先行开始，其大量生长为乳酸菌提供了厌氧环境，随着时间的延长，发酵144h后，各菌株生长达到顶峰。发酵过程中，乳酸、乙醇等物质生成，水分、蛋白含量增加，纤维、异硫氰酸酯含量降低，维生素含量动态稳定，氨基酸优质转变。因此，发酵饲料有利于提高畜禽饲养的肠道平衡、适口性和安全性。

　　04　讨论

　　目前，国内外对微生物发酵饲料在畜禽饲养中的应用和理论研究较多，也取得了一定的成果，但对发酵饲料众多代谢产物的有效成分缺乏较深入的研究，同时发酵饲料由于原材料、发酵菌株、保存等问题引发的产品稳定性问题还亟待进一步解决。因此，笔者对发酵生产的关键因素、发酵过程各菌株生长变化，发酵过程各营养成分变化情况的深入分析是十分必要的，对降低生产成本、满足不同生长阶段畜禽生长的产品细分和特异性营养需求，对将来完善发酵饲料品质鉴定、建立行业标准、促进微生物发发酵饲料的进一步研究发展均有着重要的参考依据。此外，发酵菌株的来源、种类、作用机理对发酵饲料的适应动物种类、添加剂量的选择十分重要。笔者对各发酵菌株之间的协同作用机理进行了探讨，对各菌株生长顺序、相互作用进行了相关分析，但对其稳定性、耐受性、拮抗性、有益菌株变异性及发酵菌株在畜禽中的肠道定植部位、机理还需进一步的深入研究，也是发酵饲料尚未解决和将来探索的重要方向。


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　　责编：马维军；审阅：陈达博士
　　来源：中国农学通报；生物饲料工程研究中心 作者：林标声,罗建,李益明,杨小燕


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