| 猪瘟是严重危害我国养猪业最重要的传染病之一。OIE 制定的《国际动物卫生法典》( 2002 年版) 仍将其列为 A 类法定报告传染病之一。欧美等发达国家通过疫苗免疫、扑杀等综合防制技术措施已消灭了猪瘟。在我国五十年代中国兽药监察所方世杰、周泰冲、李继庚等选育了一株适应家兔后对猪基本无毒力, 但却保持良好免疫原性的弱毒疫苗株——中国兔化弱毒疫苗株, 国外称为 C 株, 同时建立了冻干技术。因其具有免疫力强、保护率高且持久、遗传稳定、无残余毒力等优点, 是国际上公认的效果最好的猪瘟弱毒疫苗, 由此获得国家发明一等奖, 该研究曾为我国乃至世界许多国家猪瘟的防制起到了关键的作用。 但是近 20 年来, 我国猪瘟的流行形式和发病特点已经发生了很大的变化, 尤其是妊娠母猪带毒综合征、仔猪胎盘垂直传播及先天免疫耐受, 同时还存在其他多种非典型的发病特点。在出现这些现象的地区和猪场往往同时表现无法解释的免疫失败, 对我国养猪业出现的这个重大问题和难点问题, 国家已投入相关项目进行研究, 并取得了一些较新的研究进展, 综述如下。 1、猪瘟持续感染对疫苗免疫的影响 1. 1 母猪持续感染与垂直传播 母猪持续感染和仔猪胎盘感染是目前引起免疫失败的重要原因。我们首次在实验室成功地利用猪瘟野毒人工复制了猪瘟病毒持续感染的带毒母猪动物模型, 此母猪可带毒 750天。这种猪甚至可以终生带毒、排毒, 可成为猪瘟病毒的主要储存宿主, 血液中的含毒量可达105～106PF U/ m l。最早报道猪瘟胎盘感染是在 1955年, 以后此类报道逐渐增多。胎盘感染后, 引起母猪繁殖障碍,出现弱胎、死胎, 甚至木乃伊胎, 从死亡仔猪体内可分离到猪瘟病毒。为了研究持续感染母猪对仔猪的胎盘垂直传播情况, 再将这头母猪与人工感染另一株猪瘟野毒的带毒公猪或健康公猪自然交配或人工受精使其怀孕产仔, 可产下带毒的木乃伊胎和死胎,用猪瘟荧光抗体检测胎猪均为阳性, 此后该母猪不能再次配种。为了解带毒母 猪对同居猪和环境的污染情况, 在母猪带毒 273 天时, 用健康阴性猪与之同居, 可造成同居猪感染。至此成功地人工复制了猪瘟病毒胎盘垂直传播及水平传播的动物模型,在实际工作中, 这些持续感染带毒猪的存在, 可形成猪瘟常发地区和猪瘟常发猪场。由这种母猪产下的仔猪多为先天免疫耐受猪, 这种情况常常导致猪瘟在猪场形成恶性循环, 即猪瘟亚临床感染→胎盘感染→母猪繁殖障碍→仔猪带毒→后备母猪→亚临床感染。如此恶性循环, 使得带毒猪在临床中有 3% ～33%的带毒率。 1. 2 仔猪先天免疫耐受 由母猪持续感染和仔猪胎盘感染引起的免疫失败现象, 除了出现上述生产水平降低的情况外, 经胎盘感染出生后存活的仔猪往往成为持续感染者, 可长期带毒、排毒, 其本身并不表现临床症状。这种猪除了对猪场造成恶性循环外, 这种经胎盘感染的仔猪出生后, 吸允初乳, 数日内病毒血症可一过性降低, 但病毒存在于全身上皮组织、淋巴样组织和网状内皮组织, 这种感染猪不能建立中和性抗体应答, 形成免疫耐受, 以至于对疫苗免疫后不能产生免疫应答。L iess用低毒力的野毒Glento rf株给妊娠40、70、90 天的母猪滴鼻感染, 结果引起母猪繁殖障碍, 仔猪出生后多为死胎、木乃伊胎、流产, 或出生后在 1 周内到 11 周内死亡, 出生后存活的发病猪无临床症状, 剖检为胸腺萎缩、淋巴结肿大。由此证明了持续感染带毒母猪所产仔猪对疫苗免疫后不能产生保护作用的免疫耐受机制。 另外, 我们模拟生产中的实际情况, 对无临床症状的猪瘟阳性经产母猪所产仔猪进行免疫效力试验研究。两头母猪分别产下两窝仔猪, 带毒率分别为5/ 11和 12/ 14, 产仔时按仔猪产出顺序隔头进行临时猪瘟兔化弱毒疫苗接种, 1 h 后再吸初乳, 再用标准石门强毒进行攻击。免疫猪瘟疫苗不能使带毒仔猪产生免疫保护力, 接种疫苗的 5 头猪在强毒攻击后死亡4 头。结果: 猪瘟病毒持续感染对胎儿发育有不同程度的影响; 猪瘟病毒持续感染母猪可经过胎盘垂直传播病毒给仔猪, 攻击前死亡的猪全是带毒猪; 吃初乳和疫苗接种不能阻止带毒仔猪的死亡, 并且形成免疫偏离现象或免疫耐受现象, 导致免疫失败, 甚至诱发猪瘟, 通过此项试验也得到了证实。通过病理切片观察, 猪瘟病毒持续感染可导致母猪生殖器官产生病理变化, 特别是卵巢的病理变化, 使卵泡结节化, 降低或失去排卵功能, 最后导致功能障碍及繁殖障碍。 1. 3 带毒公猪的垂直传播 用 RT -PCR 检测带毒公猪自然交配所产死胎的病毒基因型, 结果表明: 死胎感染的病毒基因型与带毒母猪原有的病毒基因型不同, 而与带毒公猪的病毒基因型相同。试验证明带毒种猪不仅能通过母猪胎盘垂直传播, 而且能通过公猪精液垂直传播猪瘟, 这是造成猪瘟持续感染的又一重要原因。 综上所述, 猪瘟持续感染母猪造成的垂直传播是引起仔猪死胎、木乃伊胎、弱胎及不发病的仔猪带毒的主要原因之一, 加之它所产生的水平传播方式, 还会造成其他猪的感染并污染环境。因此一旦种猪场有猪瘟病毒持续感染的种猪存在, 就会引起免疫耐受,导致免疫失败, 时刻都有猪瘟发生的危险。因此要根除猪瘟就必须从源头抓起, 及时淘汰带毒种猪, 对种猪场进行彻底净化。 1. 4 从细胞水平和分子生物学水平证实猪瘟持续感染对机体的影响 1. 4. 1 猪瘟病毒 E0 基因对持续感染的影响 经研究证实, 猪瘟病毒的囊膜糖蛋白E0基因位于病毒粒子的表面, 对病毒的免疫、识别、吸附并进入宿主细胞是十分重要的。在猪瘟病毒感染的细胞中,E0蛋白是惟一可以分泌到猪瘟病毒浸染的细胞培养上清液中的糖蛋白。并可诱导机体产生中和抗体, 用 E0 免疫猪可诱导产生对致死剂量的保护性免疫反应, 同时也是病毒粒子吸附进入易感细胞的必须蛋白。在病毒粒子中, E0以分子量为 100 kD 的同源二聚体的形式存在, 但糖蛋白E0并不像E2那样具有跨膜区, 而是以一种未知机制连接在病毒粒子的表面上, 对猪瘟病毒在细胞中的复制、表达和调控过程中起重要作用。糖蛋白 E0 既是一种包膜糖蛋白, 又是一种核酸酶, 已有研究发现, 猪瘟 E0 基因含有与地衣类及植物核酸酶同样保守的两个氨基酸基序 SLHGIWPG( 或 E) ( 28～36位) 和 EWNKHGWC( 75～82 位) , 基序中位于 30 和79 位的 H( 组氨酸) 为 RNase 的催化活性关键氨基酸残基, 高度保守,E0蛋白的这种RNase活性已分别被试验所证实。值得注意的是,E0蛋白的RNase活性似乎与宿主细胞凋亡有关, 重组 E0 蛋白能够在体外诱导多个物种的淋巴细胞凋亡。 近年来 Hulst 等通过对 C 株基因组全长 cDNA中的 E0 基因中的关键氨基酸残基 H 进行突变, 获得了无E 0 RNase活性的病毒突变体, 表明该两区域中的 H 对 RNase 活性是不可缺少的。同时还发现由此突变株建立的无 RNase 活性的突变株能导致 SK-6细胞出现细胞病变效应(CP E) ,而这种RNase活性失活的猪瘟病毒将变成一种致病性病毒粒子, 导致细胞凋亡。推测 E0 蛋白的RNase 活性可能对病毒在宿主体内的持续感染有直接关系, 而且在病毒复制过程中有可能发挥了重要作用。同时提示E0 在毒株演化中对于病毒适应宿主细胞也可能具有重要作用, 也可以E0为靶蛋白来设计新的抗病毒策略。由此推测基因在猪瘟病毒持续感染、细胞嗜性等方面发挥重要作用。 1. 4. 2 猪瘟病毒对细胞的持续感染 利用田间分离鉴定的造成怀孕母猪与仔猪持续感染的猪瘟病毒株( CSF V39、CSF V22) 分别接种 PK15 细胞, 体外连续带毒传代。建立了稳定的猪瘟病毒持续感染细胞模型, 获得 CSFV39-PK15 和 CSFV22-PK15 病毒持续感染细胞株。用免疫荧光技术、RT -PCR技术、透射电镜跟踪监测了CSFV 39-PK15 CSFV22-PK15持续感染细胞株连续传代过程中病毒在细胞内的存在情况。结果表明CSFV39-PK15细胞连续传至 127代, CSFV22-PK15 连续传至 57 代仍有猪瘟病毒存在, 表现为病毒对细胞持续感染的基本特征。在传代过程中, 成熟病毒可以释放到细胞外, 其相对感染量比感染原液至少低 2 个数量级。实验还表明: 猪瘟病毒可持续感染 PK15 细胞并使受感染细胞正常代谢机制发生明显改善, 即持续感染的猪瘟病毒随PK15 细胞的生长繁殖而增殖, 且从被感染细胞正常代谢所需的供能物质中获得病毒复制和转录所需的能量, 从而干扰了细胞固有的生理生化过程, 使细胞的正常代谢速率减慢, 形成了细胞代谢热功率变小及相同时段内被感染细胞代谢总热量降低等病理生理现象。此项研究为在细胞水平上研究猪瘟病毒的持续感染机理奠定了基础, 同时也为研究国内温和型猪瘟的发病机理提供材料, 具有理论意义和使用价值。 疫苗接种产生的中和抗体在体外对不同野毒株的中和作用表现出了很大差异, 耐受性高的毒株在血清 4 倍稀释时才能中和, 耐受性低的毒株用 320 倍稀释的抗血清就能将其中和。如果在体内也是这样, 那么在机体处于亚免疫状态的情况下, 耐受性强的毒株就有可能侵入机体潜伏下来造成持续感染。另外, 机体的免疫状态低下也可能是造成持续感染发生的重要原因。 2 疫苗方面的因素 2. 1 猪瘟兔化弱毒疫苗的免疫效力试验 针对目前国内对于我国 C 株弱毒疫苗的疑问也作了一些试验研究, 在实验室采用非免疫猪和无猪瘟病原及抗体存在的猪进行免疫保护相关性试验, 通过试验研究发现我国疫苗株对我国目前流行的不同毒力( 高、中、低) 、不同地域、不同分离时间以及不同基因亚群的多个野毒进行单独、混合、交叉、一次及多次攻毒, 均能获得完全保护。说明我国现用的猪瘟弱毒疫苗对目前流行的猪瘟野毒仍然有效, 初步证明现用疫苗的免疫原性没有发生改变。另外法国用我国C株和T hiv erv al对慢性猪瘟病毒引起的母猪繁殖障碍均有效, 日本的GPE 疫苗株也获得了同样的结果。 2. 2 猪瘟兔化弱毒疫苗的分子生物学研究 我们对国内生产猪瘟疫苗的厂家中随机抽取部分批次的猪 瘟细胞疫苗, 共( 18 个批次) 以进行免疫基因的分子生物学研究, 对这些疫苗的E2基因主要抗原编码序列分析表明: 所有批次疫苗的核苷酸及氨基酸均呈现较高的同源性, 均为 99. 1% ～100% ; 对 3 个厂家生产的猪瘟细胞疫苗的E0基因进行研究, 没有一个碱基发生变异, 其 E0 基因结构的稳定性均保持在较高水平, 表明国内所使用的疫苗株E0基因处于稳定状态, 并且其稳定性较E2基因高; 这初步说明目前我国国内生药厂生产的猪瘟兔化弱毒疫苗基本上是稳定的, 由此证明疫苗的种毒也没有发生变异。然而猪瘟病毒在细胞培养过程中繁殖滴度较低, 因此个别厂家猪瘟牛睾丸细胞苗存在滴度不够, 由此影响到疫苗的免疫剂量, 个别地区存在着由此引起的免疫失败的现象。 2. 3 非猪瘟病毒感染对猪瘟疫苗免疫效果的影响 造成猪瘟持续感染的原因目前还不十分清楚, 经初步研究还证实: 猪瘟病毒反复多次感染及 PPV、PRV 和 PRRSV 混合感染均可造成猪瘟病毒在体内的滞留而造成持续感染。利用 20 头 9 月龄左右猪瘟、伪狂犬病、猪繁殖与呼吸障碍综合征抗原、抗体阴性猪, 将其分成 6 组, 分别利用猪细小病毒( PPV) 、猪伪狂犬病病毒(PRV ) 和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒( PRRSV ) 单独或混合感染, 7 天后, 连同对照猪 4 头, 免疫接种猪瘟兔化弱毒疫苗( HCLV) , 13 天后连同 4头阴性对照猪一起攻击猪瘟石门系强毒。整个试验期间分别每天测温, 观察临床症状, 每周采集扁桃体和血样做各种病毒抗原及抗体检测。结果在攻击石门系强毒后 2 周, 单独和混合感染了非猪瘟病毒后接种 HCLV 疫苗的 4 个免疫组12头猪除 1 头外, 11头全为HCV抗原检测阳性, 且多呈强阳性; 而单一HCLV疫苗免疫组在猪瘟强毒攻击后检测不到HCV; 所有 HCL V 疫苗免疫猪均存活, 而非免疫对照组 4 头猪全部在攻毒 16 日内死亡。试验表明非猪瘟病毒感染的确对猪瘟疫苗免疫效果有影响, 能造成猪瘟疫苗免疫的失败。 3 母源抗体及疫苗免疫程序对疫苗免疫的影响 模拟自然感染的亚临床状态和低抗体水平状态来进行不同剂量疫苗免疫效力的研究, 通过混合感染实验来对猪瘟免疫失败原因进行研究, 即从病原到机体全方位进行综合研究, 对猪瘟的防制具有十分重要的科学意义, 同时对其他产生免疫失败的疾病具有重要的指导意义。 经研究发现母源抗体滴度对猪瘟兔化弱毒疫苗的免疫保护效力有影响, 当母源抗体滴度在 16倍时,将疫苗的免疫剂量加大到 2 到 4 头份, 能抑制母源抗体干扰, 达到较好的免疫效果; 另外研究还显示低水平的母源抗体不能抵抗猪瘟野毒感染, 因此及时监测母源抗体滴度, 正确地按规程进行疫苗免疫注射能确切地抵抗野毒的感染。 另外还进行了猪瘟疫苗对带毒仔猪免疫的影响研究、人工两次野毒攻击对疫苗免疫效力的影响和猪瘟抗体水平与感染量关系的研究。结果带毒仔猪免疫后两次攻毒虽不产生临床症状, 但可隐性带毒造成垂直传播; 低水平的母源抗体不能抵抗野毒的感染, 而主动免疫后的抗体水平只要在 8 倍以上, 均能抵抗强毒的攻击。再次提示, 适当加大免疫剂量可以适应田间的带有母源抗体仔猪的免疫。 人工试验条件, 超前免疫( 0～35～70 日龄) 和 20～60 日龄免疫程序其免疫保护效果完全相同, 而且优于0～70 日龄两次和 0日龄一次免疫的免疫效果。 超前免疫后不同时间吃初乳对疫苗免疫效果的影响各不相同; 试验还证明不论吸初乳后 0. 5h或 1 h注苗, 疫苗免疫效果均不如超前免疫的效果好。因此在养猪生产中应坚持超前免疫。 除此之外, 疫苗运输的冷链系统不完善、诊断方法不特异等多方面原因也是引起猪瘟免疫失败的原因。 综上所述猪瘟的免疫失败是由上述多方面原因造成, 猪瘟的预防控制是一个复杂的系统工程。因此对后备种猪群和种猪群进行净化是防止产生繁殖障碍和恶性循环的关键手段, 清除持续感染带毒猪, 培育健康的无猪瘟带毒猪的种猪和后备种猪群是猪瘟综合防制技术的核心; 制定合理、有效的免疫程序是提高群体免疫水平的技术保障; 改善生态环境, 控制其他非猪瘟传染病是实施猪瘟综合防制技术的基础。 作者：王琴, 宁宜宝 ( 中国兽医药品监察所 国家猪瘟参考实验室, 北京 海淀 100081) |
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