饲料中磺胺二甲基嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶的测定 高效液相色谱法

　　1  范围

　　本标准规定了用高效液相色谱仪测定饲料中磺胺二甲基嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶含量的方法。

　　本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料中磺胺二甲基嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶的测定，最低检出浓度为20 mg／kg。

　　2  规范性引用文件

　　下列文件中的条款，通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

　　GB／T 6682  分析实验室用水规格和试验方法

　　GB／T 14699．1  饲料采样方法

　　3  原理

　　试样中磺胺二甲基嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶经酸性甲醇溶液超声提取后，注入高效液相色谱仪反相色谱系统中进行分离，用紫外检测器(或二极管矩阵检测器)检测，外标法计算磺胺二甲基嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶的含量。

　　4  试剂和溶液

　　除特殊说明外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水；色谱用水符合GB／T 6682中一级用水规定。

　　4．1  冰乙酸：优级纯。

　　4．2  盐酸。

　　4．3  盐酸溶液c(HCI)一0．1mol／L：取盐酸(4．2)8．5mL，溶解于1000mL水中。

　　4．4  乙腈：色谱纯。

　　4．5  甲醇：色谱纯。

　　4．6  N，N-二甲基甲酰胺。

　　4．7  提取液：在1000mL容量瓶中加入盐酸溶液(4．3)300mL，用甲醇(4．5)定容至刻度，摇匀。

　　4．8  流动相：在1000mL容量瓶中加入700mL～800mL去离子水，移取冰乙酸(4．1)3mL加入水中，用水定容至刻度，摇匀，过0．45μm滤膜。取上述溶液880mL与乙腈(4．4)120mL混合，摇匀，脱气，待用。

　　4．9  磺胺二甲基嘧啶标准品：纯度均应大于97％。

　　4．10  磺胺间甲氧嘧啶标准品：纯度均应大于97％。

　　4．11  磺胺二甲基嘧啶标准溶液

　　4．11．1  磺胺二甲基嘧啶标准贮备液：准确称取已知纯度的磺胺二甲基嘧啶标准品1 00 mg，精确至0．0001g，置于一只100mL棕色容量瓶中，加2mLN，N-甲基酰胺(4．6)及少量甲醇(4．5)超声使之完全溶解，用甲醇(4．5)定容至刻度，摇匀，该溶液中磺胺二甲基嘧啶浓度为1mg／mL，于冰箱4μ保存可使用1个月。

　　4．11．2  磺胺二甲基嘧啶标准中间液：准确移取标准贮备液(4．11．1)5mL于一只50mL棕色容量瓶中，用甲醇(4．5)定容至刻度，该溶液中磺胺二甲基嘧啶的浓度为100μg／mL，于冰箱4℃保存可使用半个月。

　　4．11．3  磺胺二甲基嘧啶标准工作液：准确移取标准中间液(4．11．2)5 mL于一只50mL棕色容量瓶中，用流动相(4．8)定容至刻度，该溶液中磺胺二甲基嘧啶浓度为10μg／mL，当日使用。

　　4．12  磺胺间甲氧嘧啶标准溶液：配制过程同磺胺二甲基嘧啶。

　　注：若同时测定两种磺胺可配制混合标准工作液。

　　4．13  磺胺二甲基嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶混合标准工作液

　　分别移取磺胺二甲基嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶标准中间液5 mL于一只50 mL棕色容量瓶中，用流动相(4．8)定容至刻度，该溶液中磺胺二甲基嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶的浓度均为10μg／mL，当日使用。

　　5  仪器

　　5．1  实验室常用仪器设备。

　　5．2  具塞锥形瓶，150mL。

　　5．3  振荡器。

　　5．4  高效液相色谱仪：配自动进样器、紫外检测器(或二极管矩阵检测器)。

　　5．5  针头过滤器：备孔径为0．45μm(或0．20μm)微孔滤膜。，

　　6  试样制备

　　选取有代表性饲料样品至少500g，四分法缩减至100g，磨碎，全部通过0．28mm孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。

　　7  分析步骤

　　7．1  试样溶液的制备

　　称取饲料样品5g(精确至0．001 g)置于具塞锥形瓶(5．2)中，加入100mL的提取液(4．7)，于振荡器(5．3)振荡提取30min，过滤，滤液过0．45μm滤膜(5．5)，待上机。

　　7．2  色谱条件

　　7．2．1  固定相  具有C18填料的柱子(粒度为4μm)：柱长150mm，内径3．9mm。

　　7．2．2  流动相  12％乙腈溶液(4．8)，以1．0mL／min流速洗脱。

　　7．2．3  进样量  20μL。

　　7．2．4  检测器  紫外检测器(或二极管矩阵检测器)，检测波长270nm。若单独测定，磺胺二甲基嘧啶检测波长可选为266 nm；磺胺间甲氧嘧啶检测波长可选为271nm。

　　8  定量测定

　　按高效液相色谱仪器说明书调整仪器操作参数。向色谱柱中注入磺胺二甲基嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶标准工作液(4．13)及试样溶液(7．1)，得到色谱峰面积响应值，用外标法定量。

　　9  结果计算

　　9．1  试样中磺胺二甲基嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶的含量分别按式(1)计算：

　　…………………………………………………..（1）

　　式中：

　　Wi试样中磺胺二甲基嘧啶或磺胺间甲氧嘧啶的含量，单位为毫克每千克(mg／kg)；

　　Pi——试样溶液峰面积值；

　　V——样品的总稀释体积，单位为毫升(mL)；

　　fi——标准溶液浓度，单位为微克每毫升(μg／mL)；

　　Vst——标准溶液进样体积，单位为微升(μL)；

　　Psti——标准溶液峰面积平均值；

　　m——试样质量，单位为克(g)；

　　Vi——试样溶液进样体积，单位为微升(μL)。

　　9．2  平行测定结果用算术平均值表示，保留两位有效数字。

　　10  重复性

　　同一分析者对同一试样同时两次平行测定结果的相对偏差不大于10％。